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更新時間：2019-02-11, 來源：國家實驗動物專家委員會簡報 2019年第8期2058

編者：1988年《實驗動物管理條例》發(fā)布實施，在實驗動物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質(zhì)量，推動我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實驗動物資源標準化、新品種/品系開發(fā)和動物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。

資源增量是實驗動物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實驗動物對生命科學研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保障。自上世紀80年代以來，在以中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所研究團隊為代表的科研機構(gòu)，通過國際合作和自主研發(fā)，建立了許多新的品系，開展質(zhì)量標準化研究，建立了對病原微生物敏感、遺傳性能穩(wěn)定和生產(chǎn)性能良好的禽類種群，為禽類疾病的研究和疫苗生產(chǎn)提供了合格的試驗材料，取得多項開創(chuàng)性成果。

為此，借“科技資訊”之窗，介紹我國實驗動物科技工作者所作的工作及取得的應(yīng)用成果。

實驗用禽類動物種群（雞、鴨）的建立與標準化

韓凌霞 孟興 佟相慧 陳洪巖

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物與比較醫(yī)學團隊，國家禽類實驗動物中心，黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，哈爾濱，150069）

禽類實驗動物，廣義指用于實驗動物的多種禽類，包括雞、鴨、鵪鶉、鴿、鵝等，但真正實現(xiàn)標準化的，只有無特定病原體（SPF）雞和SPF鴨，是生命科學領(lǐng)域中從事高水平科研和多種人畜生物制品生產(chǎn)、鑒定所不可缺少和無法替代的實驗動物和原材料，與人類健康和生物安全密切相關(guān)。下面就我國SPF雞和SPF鴨的建立與標準化做一簡單回顧。

一、雞、鴨的主要生物學特性

從動物分類學上，雞和鴨均屬鳥綱（Aves），雞屬雞形目（Galliformes）、雉科（Phasianaidae）、雞屬（Gallus），鴨屬雁形目（Anseriformes）、鴨科（Anatidae）、河鴨屬（Anus）。紅色原雞（Gallus bankiva）是現(xiàn)代家雞的祖先，家鴨起源于綠頭鴨（Anas Platyrhynchos Linnaeus）和斑嘴鴨（Anas poecilorhyncha Forster）。

SPF雞基本都選用產(chǎn)白殼蛋的雞，多數(shù)擁有白來航血統(tǒng)。白來航雞體型小而清秀，全身緊貼白色羽毛，單冠，喙、跖、皮膚均為黃色，耳葉白色，性成熟早，產(chǎn)蛋量高，蛋殼白色，無就巢性。繁殖潛力大，終年產(chǎn)蛋。消化系統(tǒng)由口腔、食道、嗉囊、胃、小腸、大腸和泄殖腔組成。在食道和胃之間有球形膨大的嗉囊，胃分為腺胃和肌胃，腺胃分泌胃液，用于消化蛋白質(zhì)，肌胃肌肉發(fā)達，可以磨碎食物，有利于消化。小腸由十二指腸、空腸、回腸組成，空腸與回腸長度大致相等，無明顯界限。大腸包括一對盲腸和直腸。直腸末端和尿生殖道共同開口于泄殖腔；泄殖腔被兩個環(huán)行褶分為糞道、泄殖道、肛道。無膀胱，尿液生成后直接排入泄殖腔。泄殖腔背側(cè)特有的法氏囊，是B淋巴細胞成熟場所，也是人類發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞的地方。血量約為體重的8%左右，常用于制備禽病特異性陽性血清。雞紅細胞呈橢圓形，表面存在對各種病毒的受體，是運用血凝試驗的最廣泛動物。紅細胞有大的細胞核，利于遺傳學研究。雞的組織相容性復合體（MHC）稱為B復合體，位于第16號染色體上，連鎖構(gòu)成一個單倍型，已命名多個B單倍型，具有共顯性遺傳特征。雞對特定疫病的敏感性與遺傳背景更密切，適于開展免疫遺傳學研究。

鴨比雞更神經(jīng)質(zhì)，性急膽小，易受外界突然的刺激而驚群，尤其對人、畜及偶然出現(xiàn)的色彩、聲音、強光等刺激均害怕而反應(yīng)強烈。生活能力強，對不利的環(huán)境條件和應(yīng)激因素有較強的適應(yīng)能力，對家禽常見的傳染病，按自然感染發(fā)病的種類，鴨比雞少1/3左右，適于人類疫苗的生產(chǎn)和檢驗，以及進行種屬屏障相關(guān)研究[1]。

二、SPF雞的培育與標準化研究

（一）SPF雞的培育

我國SPF雞群的培育始于上世紀80年代。中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所、山東家禽研究所、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、北京市獸醫(yī)生物藥品廠、北京實驗動物中心等單位先后開始培育SPF雞群。此后，SPF雞種蛋在科研和疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用逐步擴大。中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所利用中國——澳大利亞合作項目和世行農(nóng)業(yè)科研二期項目建成“SPF 禽飼養(yǎng)與保種設(shè)施”，在科技部平臺試點項目的資助下，先后從澳大利亞和美國等地引進SPF雞種蛋，應(yīng)用多年，后因種卵世代較高，近交退化嚴重，無法傳代。90年代初，從北京引進國內(nèi)優(yōu)質(zhì)培育蛋雞品種10個家系，開始自行凈化，經(jīng)過經(jīng)疫病凈化，生物學敏感性實驗和選育培育試驗等技術(shù)，定期進行疫病監(jiān)測并淘汰抗原陽性個體，凈化特定的病原和抗體，最終獲得了排除禽白血病病毒等 18 種特定病原和抗體，對新城疫病毒等 9 種病原微生物敏感，遺傳性能穩(wěn)定和生產(chǎn)性能良好的BWEL-SPF 種雞群[2-6]。MHC單倍型雞不僅影響對多種疫病的敏感性[7]，對疫苗制品的產(chǎn)量[8]，還與產(chǎn)蛋性能相關(guān)[9]。我國在本世紀初以BWEL-SPF雞為基礎(chǔ)率先開展培育國內(nèi)MHC單倍型雞，至2015年培育成功6個MHC單倍型SPF雞[10]。

（二）SPF雞的標準化

1.微生物學質(zhì)量標準

微生物學質(zhì)量是SPF雞群培育和管理的基本要求。各國和國際上對SPF雞群的疫病監(jiān)測種類沒有統(tǒng)一標準,但都著重控制經(jīng)卵垂直傳染的傳染?。弘u白痢、雞毒支原體病、滑液囊支原體和禽白血病。2008年12月31日，由中國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局和中國國家標準化管理委員會聯(lián)合發(fā)布了SPF雞微生物學監(jiān)測系列標準“GB/T 17999.1-10—2008”，規(guī)定了19種微生物學監(jiān)測項目及其檢測技術(shù)，包括檢測樣品、檢測項目、檢測程序、檢測規(guī)則、結(jié)果判定和檢測報告等，以及與其配套的9個檢測技術(shù)標準，包括瓊脂擴散試驗（AGP）；多重熒光免疫（MFIA）；血凝抑制試驗（HI）；血清平板凝集試驗（SPA）；胚敏感試驗（EST）；病原體分離（IA）；血清中和試驗（SN）；間接免疫熒光試驗（IFA）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELlSA）；試管凝集試驗（TA）；臨床觀察（CO）；：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）。與國外不同的是，未明確檢測用的病原菌、毒株。

2.遺傳學質(zhì)量標準

SPF雞品系不同會導致細胞的不同生長特性和對麻疹病毒敏感性的差異[11]。廣東省標準DB44/60-94實驗動物嚙齒類和雞的遺傳，規(guī)定了“雞的近交系是指兄妹連續(xù)交配11代以上育成的品系，近交系數(shù)90％以上”。國際建立單倍型或近交系實驗用雞的遺傳學標記全部都是根據(jù)MHC的多態(tài)性 [12]，國家禽類實驗動物種子中心選育成功的MHC單倍型雞在MHC核心區(qū)域的BF、BLB[13]和BG[14]基因符合國際對的標準遺傳學特征[15]。2017年中國實驗動物學會發(fā)布了團體標準T/CALAS 16-2017實驗動物SPF雞遺傳質(zhì)量控制，規(guī)定了SPF雞的繁殖和遺傳質(zhì)量監(jiān)測方法，適用于封閉群和MHC單倍型雞群的遺傳質(zhì)量控制。

3.配合飼料標準

SPF雞的飼育的目的是為了在保證無微生物污染的前提下生產(chǎn)無疫病抗體、無抗生素殘留、活性強的受精卵，而商品化蛋雞養(yǎng)殖場追求的是單純高產(chǎn)蛋率。美國LabDiet公司將實驗用雞的飼喂階段劃分為育雛育成和產(chǎn)蛋兩個階段，澳大利亞將SPF雞的飼料標準分為幼雛（0-6周齡）、中雛（6-20周齡）和成雞（20周齡以上），規(guī)定了粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、食鹽、維生素A和維生素D的含量。團體標準“T/CALAS 15-2017實驗動物SPF雞配合飼料”規(guī)定了SPF雞的配合飼料的質(zhì)量要求、營養(yǎng)成分測定要求、衛(wèi)生要求、檢測規(guī)則以及標簽、包裝、貯存和運輸要求，適用于SPF雞的配合飼料的質(zhì)量控制。按照0-8周齡、9-18周齡、19-24周齡和25周齡以上（至產(chǎn)蛋量下降為5%）分為育雛期、育成期、產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期，規(guī)定了8種常規(guī)營養(yǎng)成分（水分、代謝能、粗蛋白、鈣、總磷、有效磷、鈉和亞油酸）、12種氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸/胱氨酸、精氨酸、組氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）、13種維生素（A（視黃醇）、D3（膽鈣化醇）、E（生育酚）、K、B1、B2（核黃素）、B5（泛酸）、B3（煙酸）、B12（鈷胺素）、膽堿、生物素、B9（葉酸）和B6（吡哆醇））、6種微量礦物元素（錳、鋅、鐵、銅、碘和硒）等指標的最低值[16]。

4.環(huán)境設(shè)施

“GB14925-2010實驗動物環(huán)境及設(shè)施”對實驗動物雞的生產(chǎn)和實驗的屏障環(huán)境、實驗的隔離環(huán)境進行了規(guī)定，包括溫度、最大日溫差、相對濕度、最小換氣次數(shù)、動物生活處氣流速度、相通區(qū)域的最小靜壓差、空氣潔凈度、沉降菌最大平均濃度、氨濃度、噪聲、照度和晝夜明暗交替時間等技術(shù)指標，基本涵蓋了SPF雞的生產(chǎn)和實驗設(shè)施的環(huán)境要求。SPF雞飼養(yǎng)室的空氣潔凈度為7級，即≥5μm的塵粒數(shù)在293個/m3-2930個/m3 之間；沉降菌最大平均濃度不大于3個CFU/0.5h?φ90 mm平皿。

5.飼養(yǎng)管理指南

團體標準“T/CALAS 38-2017 實驗動物 SPF雞和SPF鴨飼養(yǎng)管理指南”規(guī)定了SPF雞場的基本條件、環(huán)境與設(shè)施、引種、運輸、飼養(yǎng)及生產(chǎn)管理、廢棄物及尸體處理、問題處置的要求，將設(shè)施按功能區(qū)分為輔助區(qū)和生產(chǎn)區(qū)，生產(chǎn)區(qū)應(yīng)設(shè)有孵化室、儲蛋庫、更衣室和隔離檢疫室，處于屏障環(huán)境。使用后的隔離器應(yīng)采用加熱硅油和多聚甲醛蒸汽消毒；應(yīng)用細砂紙或40℃的0.1%新潔爾滅溶液擦拭去除蛋表面的污物；育雛早期環(huán)境溫度應(yīng)隨日齡而調(diào)整；建議采用本交方式交配，減少人工受精環(huán)節(jié)的污染；一般在4周齡進行遺傳學質(zhì)量監(jiān)測；20-22周齡時留種禽；病原學質(zhì)量監(jiān)測按照GB/T 17999.1-2008進行；一般在7～10日齡時斷喙（上喙1/2處，下喙1/3處），剛斷喙時可增加飼料厚度，直至傷口愈合；飼喂過程要盡量輕柔安靜，避免突然噪聲；隨時觀察產(chǎn)蛋母雞背部受傷情況，及時用紫藥水處理，防止其它禽群起啄之。

6.運輸

2018年1月黑龍江省標準“DB23/T 2057.8-2017實驗動物運輸隔離器通用技術(shù)要求” 開始實施，規(guī)定了包括禽類在內(nèi)的實驗動物運輸隔離器通用技術(shù)要求的術(shù)語和定義、構(gòu)造、材料要求、技術(shù)要求、檢測，適用于運輸小、中、大型清潔、無特定病原體、無菌（含悉生）級實驗動物的隔離器。體重小于2 kg的雞，籠內(nèi)最小高度0.4 m，每只雞的底板面積0.02 m2-0.12 m2；體重大于2 kg的雞，籠內(nèi)最小高度為0.6 m，每只雞的底板面積為0.15 m2.。

三、SPF鴨的培育和標準化

（一）SPF鴨的培育

實驗動物鴨可用于生理學、病毒學、內(nèi)分泌學、營養(yǎng)學、藥埋學等研究，用作建立肝炎動物模型，也是疫苗的研制與生產(chǎn)的重要原料，特別對禽流感、小鵝瘟、新城疫、雞傳支、呼腸孤等疫苗有重要意義。中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所從2005年開始培育SPF鴨，以我國優(yōu)秀地方培育品種紹鴨百殼I號為基礎(chǔ)，全部生命周期都飼養(yǎng)于正壓隔離器中，經(jīng)過種卵滅活疫苗免疫、阻斷物流/人流污染、鈷60輻照飼料和酸化飲水等措施，以閉鎖群方式繁殖。經(jīng)過分子遺傳學分析[17]、組織學分析[18]、疫病敏感性試驗[19]、生化位點[20]、解剖學數(shù)據(jù)測定[21]、生理生化數(shù)據(jù)測定[22]和MHC區(qū)域的遺傳學結(jié)構(gòu)分析[23]，已成為成熟、穩(wěn)定的SPF鴨群，在禽病研究中發(fā)揮了重要的作用。至今已排除了鴨病毒性腸炎等9種疫病，是國內(nèi)唯一的SPF種鴨群，命名為HBK鴨。根據(jù)與MHC核心區(qū)域的tap2基因選育出4個單倍體型HBW/B1、B2、B3和B4。

（二）SPF鴨的標準化

1.微生物學質(zhì)量控制

“T/CALAS 18-2017 實驗動物 SPF鴨微生物學監(jiān)測總則”規(guī)定了SPF鴨的微生物學種類，及其檢測程序、檢測規(guī)則、結(jié)果判定和檢測報告等要求。適用于SPF鴨和鴨胚的微生物學控制。規(guī)定排除的疫病項目包括9種，沙門菌感染、禽霍亂、鴨傳染性漿膜炎、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病減蛋綜合征、鴨病毒性肝炎、鴨病毒性腸炎、禽流感和新城疫。檢測樣品包括鴨血清、全血、鴨胚、咽拭子和泄殖腔拭子。首次檢測從4-8周齡開始。SPF鴨每世代至少監(jiān)測2次。對所有飼養(yǎng)單元的鴨進行全部項目的檢測，每個飼養(yǎng)單元按15％的比例抽樣。全部項目的檢測結(jié)果均為陰性者，判為合格；若有1項（含1項）以上為陽性，則判為不合格。

2.遺傳學質(zhì)量控制

“T/CALAS 37-2017 實驗動物 SPF鴨遺傳學質(zhì)量監(jiān)測”適用于封閉群鴨和MHC單倍型鴨的遺傳學質(zhì)量控制，規(guī)定了封閉群和MHC單倍型的交配方式，類似于SPF雞的遺傳學質(zhì)量監(jiān)測，不同的是單倍型的檢測以tap基因的純化性為依據(jù)。

3.配合飼料標準

SPF鴨與商品蛋鴨在飼養(yǎng)環(huán)境和使用目的迥異。最近頒布的“T/CALAS 17-2017 實驗動物SPF鴨配合飼料”是參照美國NRC（1994）和我國商業(yè)行業(yè)標準SB/T 10262-1996制定的，將SPF鴨以0-8周齡、9-19周齡、20-30周齡和31周齡至產(chǎn)蛋率下降為5%，分別作為育雛期、育成期、產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期。規(guī)定的指標與SPF雞相同。

4.飼養(yǎng)管理

SPF鴨的飼養(yǎng)管理同樣包含在“T/CALAS 38-2017 實驗動物 SPF雞和SPF鴨飼養(yǎng)管理指南”里。

四、實驗用禽類（雞、鴨）實驗動物種群的建立與意義

2006年全國只有7家SPF雞卵生產(chǎn)企業(yè)[24]，2006年最大生產(chǎn)能力1245萬枚，至2015 年全國已有10個省( 自治區(qū)、直轄市) 生產(chǎn)雞胚，主要集中在山東、北京、浙江和黑龍江，SPF雞胚的生產(chǎn)量達4千萬余枚[25]。

SPF雞和SPF鴨被大量用于病毒的分離、純化、滴定、拯救，以及禽病疫苗的免疫效果評估、禽病原微生物的致病分子機制等方面的研究工作，僅禽流感研究每年都要消耗萬余枚雞胚。取得了豐碩的成果。優(yōu)良的SPF雞胚為973、863、科技支撐計劃、國家自然基金等多個項目的順利進行提供了必須的實驗材料，為各項科研工作順利進行提供了扎實的物質(zhì)基礎(chǔ)和條件支撐。通過慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因雞的研究也已取得了突破性進展，相信隨著品種品系數(shù)量和質(zhì)量的不斷增加，實驗用禽類將在生命科學領(lǐng)域扮演更重要的角色。