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美鳳力臨床前大動物實(shí)驗(yàn)中心
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高血壓（hypertension）影響全世界約10億人，約占全球疾病負(fù)擔(dān)的4.5%。原發(fā)性高血壓是一種由遺傳、環(huán)境及行為因素共同作用的復(fù)雜性疾病，占高血壓患者的90%以上。高鹽攝入是重要的環(huán)境因素之一。血壓對鹽攝入的反應(yīng)具有顯著的個體差異，Kawasaki等和Luft等基于此先后提出了“血壓鹽敏感性”。血壓鹽敏感性也是心血管疾病的一個獨(dú)立危險(xiǎn)因素。一般人群中血壓鹽敏感者約占20% ～ 30%，而原發(fā)性高血壓人群中血壓鹽敏感者約占50% ～ 60%。因此，有效的管理鹽敏感性高血壓是提高公共健康的關(guān)鍵。胃泌素（Gastrin，Gast）是一種主要由G細(xì)胞分泌的肽激素，作用于其受體膽囊收縮素B受體（Cholecystokinin B Receptor，CCKBR）以減少腎的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)及腸道鈉吸收。Gast在調(diào)節(jié)鈉平衡和血壓方面具有重要作用，已有研究發(fā)現(xiàn)小鼠全身缺乏Gast（Gast-/-）或僅在腸道缺乏Cckbr（Cckbr-/-）可減少小鼠鈉排泄且小鼠血壓升高。Gast在鹽敏感性方面也很重要，因?yàn)榈外c攝入的Gast小鼠血壓正常，但在正?；蚋哜c攝入時(shí)會出現(xiàn)高血壓。全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-wide Association Studies，GWAS）表明，Gast和Cckbr的染色體位點(diǎn)與高血壓相關(guān)。
動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床一致性是評價(jià)動物模型的重要指標(biāo)。盡管常用的近交系小鼠因遺傳背景的一致性而廣泛應(yīng)用，但這種單一性限制了其模擬人類遺傳背景多樣性的能力。人類的基因組中總共有超過8800萬個遺傳變異（包括約8470萬個單核苷酸多態(tài)性、360萬個插入/缺失變異和約6萬個結(jié)構(gòu)變異），這種多樣性是導(dǎo)致疾病表型差異的主要原因。例如，在不同種族間銀屑病的臨床表現(xiàn)差異以及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2）的DNA多態(tài)性與新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的易感性和嚴(yán)重程度相關(guān)。為了克服這一限制，國際復(fù)雜性狀聯(lián)盟（Complex Trait Consortium，CTC）提出創(chuàng)建遺傳多樣性小鼠資源。選定8個品系的小鼠（A/J、129S1Sv/ImJ、NZO/H1LtJ、NOD/ShiLtJ、C57BL/6J、PWK/PhJ、WSB/EiJ、CAST/EiJ）作為原始親本小鼠。其中前5個品系是實(shí)驗(yàn)室常用的近交系小鼠，后3個是野生型小鼠，這8個品系的小鼠覆蓋了90%小鼠的遺傳變異。這8個品系相互重組雜交3代，得到F3代雜交小鼠，而后將F3代雜交小鼠進(jìn)行20代以上的近交，得到一系列的遺傳多樣性近交品系。
高血壓的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，涉及多種遺傳和環(huán)境因素及其相互作用，其潛在的發(fā)病機(jī)制包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（Research Analyst Assessment Specialist，RAAS）、醛固酮依賴性和醛固酮非依賴性鹽皮質(zhì)激素受體（Mineralocorticoid Receptor，MR）信號通路。這些機(jī)制通過激活腎中的鹽皮質(zhì)激素受體，促進(jìn)Na+/K+-ATP酶的活性，進(jìn)而增加腎對Na的重吸收，導(dǎo)致血壓升高。相反，胃泌素能夠降低Na+/K+-ATP酶的活性和抑制上皮鈉通道（Epithelial Sodium Channel，ENaC）的活性，減少Na+的重吸收。本研究中使用的Cckbr基因敲除小鼠能夠部分模擬MR信號通路對高血壓的影響，并利用攜帶36 M單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNPs）的協(xié)同重組近交系小鼠，增加了高血壓小鼠模型的遺傳多樣性，使其表型更接近臨床表現(xiàn)。構(gòu)建遺傳多樣性高血壓小鼠模型在血壓表型、病理特征以及基因表達(dá)上展現(xiàn)出顯著的品系間差異，類似于人類高血壓患者之間的差異，從而有效地模擬了遺傳異質(zhì)性對疾病表型的影響。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了使用遺傳多樣性高的動物模型在高血壓研究中的重要性，為理解疾病的遺傳基礎(chǔ)和開發(fā)新的治療策略提供了寶貴資源。
實(shí)驗(yàn)動物選擇：
親本小鼠：13個品系的遺傳多樣性小鼠（A/J、FIM、GIG、POH、FEW、CIS、LOT、NUK、129、NOD、TOFU、PIPING、LAM）及Cckbr/-小鼠。13個品系的子代小鼠共390只，3 ～ 4月齡，體重約30 g, 雌雄各半，SPF級，均飼養(yǎng)于SPF屏障環(huán)境，溫度23 ～ 26 ℃，濕度50% ～ 60%，晝夜明暗交替12 h/12 h，小鼠自由飲水采食。
小鼠的繁殖策略與分組：
將13個品系的遺傳多樣性小鼠（A/J、FIM、GIG、POH、FEW、CIS、LOT、NUK、129、NOD、TOFU、PIPING、LAM）分別與Cckbr-/-小鼠雜交，得到基因型為Cckbr+/-的F1代小鼠，將其與同窩Cckbr+/-小鼠進(jìn)行交配，而后將F2代小鼠按照其基因型分為Cckbr+/ +組、Cckbr+/-組、Cckbr-/-組（每組10只，雌雄各半）,飼養(yǎng)至3 ～ 4月齡。其中，Cckbr+/-組和Cckbr-/-組為實(shí)驗(yàn)組，Cckbr+/+組為對照組。
將13個品系的遺傳多樣性小鼠分別與傳統(tǒng)近交系鹽敏感高血壓小鼠模型雜交，發(fā)現(xiàn)不同品系的子代遺傳多樣性小鼠鹽敏感性也是不同的，從中篩選了3個鹽敏感品系，分別為A/J、LOT和FIM。鈉水調(diào)節(jié)紊亂是鹽敏感性高血壓發(fā)病的主要誘因。通過對鹽敏感LOT品系小鼠腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因富集在蛋白激酶C活化的G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、細(xì)胞外區(qū)域和外泌體、胰島素樣生長因子（Insulin-Like Growth Factors, IGF）的結(jié)合、新陳代謝與晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等方面。已有研究發(fā)現(xiàn)，在相應(yīng)的動物模型中靶向干擾生物鐘基因?qū)⒂绊懩I鈉排泄、BP和神經(jīng)內(nèi)分泌節(jié)律。
值得注意的是，與其他兩個鹽敏感品系不同，F(xiàn)IM品系小鼠Cckbr-/-組較Cckbr+ / +組收縮壓顯著降低（P< 0.05）。事實(shí)上，整個有機(jī)體并不是簡單的各部分的總和，而是一個新的整體，其中各種通路之間的相互作用是復(fù)雜的，并有助于個體的反應(yīng)。
近年來，人們越來越懷疑傳統(tǒng)近交系小鼠模型的實(shí)用性，部分原因是使用這些模型的研究未能轉(zhuǎn)化為成功的治療方法。然而，許多傳統(tǒng)小鼠模型的共同特征是缺乏遺傳多樣性。無論使用哪種特定的小鼠品系，使用單一遺傳背景都排除了個體遺傳多樣性對疾病發(fā)生和發(fā)展的影響。有研究表明臨床前動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性的差異是目前人類疾病研究及藥物開發(fā)亟待解決的難題，特別在受多基因影響的復(fù)雜疾病的研究中。將極有可能無效無益的藥物投入臨床試驗(yàn)是一種資源的極大浪費(fèi)，也是對臨床試驗(yàn)患者的責(zé)任缺乏。鹽敏感高血壓在臨床表現(xiàn)上存在個體差異，因此通過單一遺傳背景的小鼠已無法建立有效的動物模型復(fù)制此類疾病。此外，通過對多個品系的小鼠進(jìn)行抽樣，人們可以更容易地對藥物效應(yīng)、不同條件下的行為差異和各種實(shí)驗(yàn)范式進(jìn)行概括性研究，而不是將自己的研究局限于C57BL/6或?qū)嶒?yàn)室傳統(tǒng)近交系。在這里，研究人員將實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)近交系背景下的鹽敏感高血壓小鼠模型與遺傳多樣性小鼠品系進(jìn)行雜交，作為一個新的臨床前資源，旨在將豐富的遺傳變異引入傳統(tǒng)近交系鹽敏感高血壓小鼠模型中，以調(diào)查遺傳多樣性對鹽敏感高血壓的表型、分子機(jī)制等方面的影響，以及對干預(yù)或治療措施的反應(yīng)。鑒于該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)，以及越來越多的人意識到遺傳背景影響各種復(fù)雜性狀。在未來，如果將遺傳多樣性納入各種復(fù)雜性疾病的臨床前研究，將大大提高人類疾病小鼠模型的整體轉(zhuǎn)化潛力。此外，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)很可能廣泛適用于以轉(zhuǎn)基因的形式所構(gòu)建的人類疾病小鼠模型，這樣的模型將更加貼近真實(shí)世界的人群。在這些情況下，鑒定影響疾病發(fā)生或嚴(yán)重程度的遺傳因素，將有利于對疾病發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入了解?？偟膩碚f，遺傳多樣性小鼠是一個寶貴的資源，將更廣泛地應(yīng)用于各種復(fù)雜性狀疾病的研究中，成為人類發(fā)現(xiàn)疾病生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)一步認(rèn)識疾病的“新工具”。
Source: 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào). 2024，32 （05），遺傳多樣性高血壓小鼠模型的建立與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
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