更新時(shí)間：2019-01-22, 來源：國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專家委員會(huì)簡(jiǎn)報(bào) 2019年第6期2062
與基因工程小鼠等動(dòng)物制備相比，遺傳修飾NHP動(dòng)物存在制備效率、操作難度、研究成本等多個(gè)瓶頸。以至于致在轉(zhuǎn)基因小鼠出生后近20年后，才獲得世界上首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因猴[23]。但是，ZFNs、TALENs和CRISPR/cas9等高效基因編輯技術(shù)的成熟和應(yīng)用，促使NHP基因編輯動(dòng)物制備進(jìn)入了快車道，亨廷頓舞蹈病、帕金森病、抑郁癥等NHP疾病動(dòng)物模型相繼誕生[24,25]。
但是，對(duì)糖尿病而言，目前尚無相關(guān)NHP基因工程動(dòng)物制備的研究報(bào)道。我們認(rèn)為，制備基因工程N(yùn)HP糖尿病模型動(dòng)物可能存在以下幾方面限制：一是臨床發(fā)現(xiàn)，90%以上2型糖尿病患者表現(xiàn)為基因表達(dá)改變而非基因編碼改變[26-28]，雖然已證實(shí)某些T2DM患者的單基因突變是致病原因，但點(diǎn)突變患者在T2DM發(fā)病人群中的比例較低，因而基于該突變位點(diǎn)制備的基因工程動(dòng)物在臨床上的代表性存疑；二是人們利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association studies, GWAS）在T2DM上發(fā)現(xiàn)了100多個(gè)關(guān)聯(lián)SNP[26-28]，顯然要對(duì)如此多的DNA位點(diǎn)進(jìn)行遺傳操作，目前還存在技術(shù)困難。此外，靈長(zhǎng)類動(dòng)物的世代間隔長(zhǎng)（5~6年），且為單胎，即使獲得了能穩(wěn)定遺傳的糖尿病模型小樣本，按照小鼠模型培育需要8~10代[29]計(jì)算，種群培育的漫長(zhǎng)周期，使得該途徑的可行性和實(shí)用性也大受影響。
（四）糖尿病易感NHP種群的篩選和建立
臨床流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，對(duì)于糖尿病遺傳家族人群，如果合理飲食及運(yùn)動(dòng)，可能減少疾病發(fā)生；相反，非糖尿病敏感人群，如果長(zhǎng)期攝入高糖、高脂食物，且不注意運(yùn)動(dòng)等活動(dòng)，也可能增加患病風(fēng)險(xiǎn)。也就是說，糖尿病是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[26-28]。根據(jù)糖尿病的上述特征，目前培育的糖尿病模型動(dòng)物種群（如kkay小鼠、DZF大鼠等）主要通過表型選育獲得。
正如前面上述，NHP自然發(fā)病動(dòng)物多為中老年，且兼具世代間隔長(zhǎng)和單胎等特點(diǎn)，表型選育難以形成穩(wěn)定遺傳的種群。
最近，我們實(shí)驗(yàn)室利用人T2DM的遺傳數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)挖掘——基因組映射——特定靶點(diǎn)高通量測(cè)序這一嶄新途徑，獲得了猴T2DM關(guān)聯(lián)SNP；建立了猴T2DM遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型；篩選建立了T2DM易感猴繁育種群。
首先，利用人T2DM的遺傳數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析，挖掘到可能人T2DM關(guān)聯(lián)的基因組片段276個(gè)，將其映射到食蟹猴基因組。采用均衡病-健小樣本（82/85）對(duì)上述特定靶點(diǎn)進(jìn)行高通量測(cè)序，得到與T2DM關(guān)聯(lián)的SNPs共99個(gè)。利用99個(gè)關(guān)聯(lián)SNPs建立猴T2DM遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與動(dòng)物實(shí)際表型一致性為79.64%（133/167）；而以關(guān)聯(lián)程度最高的30個(gè)SNPs進(jìn)行T2DM風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，其結(jié)果與99個(gè)SNPs基本一致。
進(jìn)一步對(duì)兩種遺傳預(yù)測(cè)模型的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)在0.4~0.6之間時(shí)，預(yù)測(cè)結(jié)果與動(dòng)物實(shí)際表型差異較大（一致性約為62%~65%）；而當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)≤0.4或者≥0.6時(shí)，預(yù)測(cè)結(jié)果與動(dòng)物實(shí)際表型的一致性顯著提高（大于80%）。基于上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我們提出了T2DM易感猴的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：對(duì)99個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，當(dāng)99-SNPs和30-SNPs的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)同時(shí)≥0.6，該動(dòng)物為T2DM易感個(gè)體；當(dāng)兩種模型獲得的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)同時(shí)≤0.4，該動(dòng)物為T2DM不敏感個(gè)體。利用該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所測(cè)試的167只猴進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際表型的一致性超過85%。
最后，從所測(cè)試的表觀正常猴中挑選T2DM高風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物8只、中度風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物6只（99-SNPs或30-SNPs的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)為0.4~0.6）和低風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物13只，同時(shí)飼喂高能量飼料32 w。高風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物在20 w左右開始出現(xiàn)高血糖表型，最終6只猴出現(xiàn)糖尿病病變（75.0%，6/8），1只猴雖然血糖值仍在正常水平，但糖耐量受損（12.5%，1/8），而另1只猴糖代謝正常（12.5%，1/8）；6只中度風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物，1只出現(xiàn)糖尿病病變（16.7%，1/6），3只僅表現(xiàn)糖耐量受損（50.0%，3/6），2只動(dòng)物糖代謝正常（33.3%，2/6）；而13只低風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物，糖代謝全部正常。
目前，課題組測(cè)試了334只中青年繁殖猴，獲得了86只（在猴群中的比例為25.75%）T2DM遺傳高風(fēng)險(xiǎn)猴（即99-SNPs和30-SNPs風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)同時(shí)≥0.6的動(dòng)物）。其中雌性75只，雄性11只，根據(jù)雌雄動(dòng)物SNP位點(diǎn)的基因型，86只T2D高風(fēng)險(xiǎn)猴組成了10個(gè)繁殖單元。
關(guān)聯(lián)SNP研究以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)篩選為T2DM等復(fù)雜遺傳性疾病NHP模型動(dòng)物種群建立提供了新途徑，但種群的遺傳穩(wěn)定性還需要后代表型分析支持。課題組將及時(shí)對(duì)T2DM敏感猴群的后代進(jìn)行測(cè)試，以檢驗(yàn)該方法的可靠性。
三、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物糖尿病模型種群的標(biāo)準(zhǔn)化研究
與人T2DM發(fā)病進(jìn)程一樣，NHP動(dòng)物在疾病不同階段展現(xiàn)不同特征，到疾病后期，因高糖損傷而導(dǎo)致的心腦血管系統(tǒng)、腎臟組織等綜合癥將直接威脅到動(dòng)物生命。因此，猴群定期監(jiān)測(cè)、飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)、發(fā)病動(dòng)物護(hù)理是種群標(biāo)準(zhǔn)化研究的重要內(nèi)容。
（一）NHP糖尿病模型種群監(jiān)測(cè)
1、空腹血糖：盡管不斷有T2DM新的診斷指標(biāo)被報(bào)道，但空腹血糖值仍然是糖尿病最直接的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)人而言，WHO標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)空腹血糖≥7.0 mmol/L時(shí)為顯性糖尿??；餐后2 h血糖值>7.8 mmol/L時(shí)，為糖耐量受損。
而猴子等NHP動(dòng)物的血糖值目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)正常猴與健康人群的血糖值比較發(fā)現(xiàn)，NHP動(dòng)物的血糖值通常較人低1.0~1.77 mmol/L。因此，猴的空腹糖>5.6 mmol/L時(shí)，即可能患病[30]。但也有研究報(bào)道認(rèn)為，以人的指標(biāo)（即空腹血糖≥7.0 mmol/L）作為猴糖尿病依據(jù)更準(zhǔn)確[20]。
與人不同的是，動(dòng)物的空腹血糖容易受操作過程影響。比如劇烈的保定操作以及麻醉劑都可能導(dǎo)致血糖值異常波動(dòng)。對(duì)于猴子等NHP動(dòng)物，目前主要采用兩種方法確認(rèn)動(dòng)物的實(shí)際血糖值。一是不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果比較；二是使用對(duì)血糖幾乎沒有影響的麻醉劑（如氯胺酮，劑量為10mg/kg體重）鎮(zhèn)靜后測(cè)試[31]。
另外，猴子等NHP動(dòng)物的空腹時(shí)間也有別于人和其他動(dòng)物。猴等NHP動(dòng)物口腔兩側(cè)有頰囊結(jié)構(gòu)，攝食時(shí)部分食物首先儲(chǔ)存于頰囊中，然后在返回口腔咀嚼消化。因此，在測(cè)定猴子等NHP的空腹血糖時(shí)，動(dòng)物禁食時(shí)間較人和無頰囊動(dòng)物長(zhǎng)[20]。
我們反復(fù)比較了猴的空腹血糖測(cè)定，獲得了較為穩(wěn)定的結(jié)果。程序如下：猴禁食（不禁水）13~14 h；用10mg/kg體重氯胺酮肌肉注射麻醉；15~20min后采后肢靜脈血1.5~2.0mL；離心收集血清；在生化儀上測(cè)定血糖值。
此外，在測(cè)定動(dòng)物血糖值時(shí)，經(jīng)常用血糖試紙條測(cè)定全血。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，全血的血糖值通常較血清低0.3~0.7mmol/L。
2、糖耐量試驗(yàn)：與血糖值相比，糖耐量試驗(yàn)被認(rèn)為是糖代謝正常與否的金標(biāo)準(zhǔn)。在人上，糖耐量試驗(yàn)包括口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）和靜脈注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（intravenous glucose tolerance test，IVGTT）兩種方式。
但對(duì)于NHP等動(dòng)物而言，糖耐量試驗(yàn)主要采用IVGTT方法，以利于精確控制葡萄糖用量。我們對(duì)Bremer等[20]報(bào)道的方法進(jìn)行了改進(jìn)，即猴禁食13~14 h；肌肉注射麻醉氯胺酮10mg/kg體重；分別在麻醉劑注射后10~15min、20~25min采后肢靜脈血兩次，每次1.5~2.0mL；第二次采血后，同時(shí)靜脈注射50%葡萄糖溶液1.2mL/kg體重；分別在葡萄糖注射后5、10、15、30、60、90、120、150min取后肢靜脈血1.5~2.0mL；離心獲得血清，測(cè)定血糖值和血清胰島素。計(jì)算血清葡萄糖曲線下面積（Area under the curve of glucose tolerance test）、血清胰島素曲線下面積（Area under the curve of blood insulin）、胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）。根據(jù)上述指標(biāo)，可判定種群中不同動(dòng)物所處的發(fā)病時(shí)期。
3、其他理化指標(biāo)：除血糖和糖耐量試驗(yàn)外，對(duì)種群定期監(jiān)測(cè)還包括以下指標(biāo)：血清胰島素、C反應(yīng)蛋白、糖化血紅蛋白、血脂（總膽固醇、HDL-C、LDL-C、TG、apoA1、apoB、apoC3等）、脂肪細(xì)胞激素（脂聯(lián)素、瘦素等）、促炎標(biāo)志物（CRP、MCP-1、PAI-1等分子）、體重（包括體重指數(shù)）、攝食量。雖然這些指標(biāo)不是糖尿病的核心診斷標(biāo)志，但可為動(dòng)物的病程判定和劃分提供有益幫助。
理論上，血清胰島素、C反應(yīng)蛋白和糖化血紅蛋白對(duì)于糖尿病診斷有較高的價(jià)值和意義。但我們?cè)诤镅芯恐邪l(fā)現(xiàn)，血清胰島素波動(dòng)幅度太大，相反C反應(yīng)蛋白和糖化血紅蛋白又不敏感，不適合作為猴等NHP動(dòng)物糖尿病的重要標(biāo)志。
（二）NHP糖尿病模型種群飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)
高糖高脂飼料當(dāng)前廣泛應(yīng)用于糖尿病模型動(dòng)物制備，對(duì)于猴等NHP動(dòng)物而言，目前已有商品化的高能量飼料。Bremer等[31]在飼喂商品化高能量飼料的同時(shí)，額外給予猴飲用含果糖（75g/天/只）的飲料，最終29只恒河猴飼喂一年后，4只猴發(fā)展成為顯性糖尿?。崭寡侵怠?.0 mmol/L），其余25只都表現(xiàn)代謝綜合癥的某些特征。
我們前期在T2DM遺傳高風(fēng)險(xiǎn)猴的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需求、食物可口性、飼料堅(jiān)硬度等指標(biāo)，最終組成了如下高能量飼料配方：基礎(chǔ)全價(jià)飼料55%；牛油25%；蔗糖7.0%；果糖7.0%；膽固醇1.0 %；酪蛋白3.0%；微量元素1.5%；復(fù)合維生素0.5%。利用該高能量飼料，動(dòng)物最早在20 w即出現(xiàn)顯性糖尿病表型（空腹血糖值≥7.0 mmol/L），飼喂32 w，8只T2DM遺傳高風(fēng)險(xiǎn)猴有6只發(fā)展成為糖尿病。
而采用食物攝入量限制等措施，不僅延長(zhǎng)了糖尿病猴的壽命，而且明顯影響猴糖尿病的進(jìn)程和并發(fā)癥的發(fā)生。
這些研究表明，根據(jù)實(shí)際需求調(diào)整猴等NHP模型種群的飼料標(biāo)準(zhǔn)，既可減少動(dòng)物本身的疾病痛苦，又能保證寶貴資源的最大利用。
（三）NHP糖尿病動(dòng)物的護(hù)理
與人一樣，猴等NHP動(dòng)物一旦確診為糖尿病，需要對(duì)發(fā)病動(dòng)物進(jìn)行精心護(hù)理，防止動(dòng)物意外死亡，控制糖尿病性腎病、糖尿病性心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病性眼病、糖尿病性周圍神經(jīng)病變等并發(fā)癥。
Hansen等根據(jù)多年的研究結(jié)果，總結(jié)了一套糖尿病猴及其并發(fā)癥的護(hù)理方案。其核心內(nèi)容包括：（1）當(dāng)猴首次被確診為糖尿病時(shí)，動(dòng)物體重將逐漸下降，此期如果不需要控制病情發(fā)展，動(dòng)物不需要藥物處理。（2）如果早期需要治療，可給動(dòng)物口服二甲雙胍等、PPAR激動(dòng)劑、吡格列酮等降糖；二甲雙胍用量為500~1000mg/天/只，如果動(dòng)物血糖值仍然處于高位，二甲雙胍可加倍使用；二甲雙胍通常可在一年或數(shù)年內(nèi)能有效控制發(fā)病動(dòng)物體重下降和并發(fā)癥產(chǎn)生。（3）對(duì)于發(fā)病2~3年（也許時(shí)間更長(zhǎng)）的動(dòng)物，口服藥物效果不佳，特別是動(dòng)物出現(xiàn)高血糖（攝食后3~5 h血糖值超過160mg/dL）、體重急劇下降、尿糖和尿蛋白明顯增加等臨床表現(xiàn)時(shí)，可給予胰島素治療；最好選用長(zhǎng)效胰島素，初始劑量為1~2IU/只，也可根據(jù)動(dòng)物的血糖控制情況，調(diào)整胰島素用量。（4）當(dāng)動(dòng)物長(zhǎng)期疾病而出現(xiàn)低血糖（35mg/dL）表現(xiàn)時(shí)，通?？赡苁且?yàn)槭褂昧艘葝u素，或者動(dòng)物攝食量明顯減少所致；護(hù)理上可通過提高食物和飲料的可口性增加動(dòng)物攝食，也可通過胃管和靜脈注射等方式補(bǔ)充葡萄糖，直到動(dòng)物的血糖值達(dá)到120mg/dL以上；低血糖猴的治療方案與患者完全相同，如果需要，甚至可給予胰高血糖素。
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