編者：資源增量是實驗動物科技發(fā)展的核心任務，是實驗動物對生命科學研究提供支撐和服務的基礎和保障。自上世紀80年代以來，我國老一輩實驗動物科學家苦心孤詣，在實驗動物資源研發(fā)工作中取得了多項開創(chuàng)新成果。
1988年《實驗動物管理條例》發(fā)布實施，在實驗動物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質(zhì)量，推動我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實驗動物資源標準化、新品種/品系開發(fā)和動物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國實驗動物專家在此領域所作的工作及取得的應用成果。
非人靈長類模式動物
非人靈長類動物為社群性動物，具有明顯的社會等級關系和復雜的行為活動，相對于常用的嚙齒類實驗動物，非人靈長類在生理、解剖、行為和生物醫(yī)學特性上更接近于人類，是醫(yī)學和生命科學研究中的高級實驗動物，在人類疾病防控的疫苗研制研發(fā)、人類腦功能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中具有其他實驗動物難以替代的作用。隨著對人類醫(yī)藥和健康研究的深入，低等模式動物在一些領域已經(jīng)不能滿足研究的需要，迫切需要建立諸如猴等進化上與人類更接近的動物模型。
一、非人靈長類模式動物構建技術發(fā)展簡史和面臨的問題
哺乳動物轉基因技術依賴于輔助生殖和胚胎操作。小鼠上早在上個世紀80年代就已經(jīng)建立基因原核注射的過表達轉基因技術和基于胚胎干細胞的基因敲出和敲入技術。這不僅僅是因為小鼠是最常用的實驗動物，早在上個世紀初就培養(yǎng)了大量遺傳背景一致的近交系，還因為小鼠具有多胎生殖、性成熟和繁殖周期短等天然優(yōu)勢。而最為廣泛使用的非人靈長類實驗動物食蟹猴和恒河猴不僅遺傳背景復雜，且為有月經(jīng)周期的單胎生殖，即每個月經(jīng)周期排卵1-2枚，而其性成熟時間更是長達4年以上，加上近半年的懷孕期（約160-170天），這樣整個繁殖周期要在5年以上，同時，目前也沒有得到可生殖系傳代的胚胎干細胞。在胚胎資源有限和低繁殖能力這一天然劣勢的限制下，非人靈長類模式動物構建技術進展相對緩慢。2001年，美國俄勒岡健康科學大學的Schatten教授團隊利用高滴度的逆轉錄病毒載體成功將外源基因?qū)牒愫雍锏呐咛ィ@得了世界上首只轉基因靈長類動物ANDi（意指inserted DNA），雖然在其得到的3只出生個體中僅有1只檢測到了外源基因GFP的整合和嵌合表達，但這一開創(chuàng)性的工作標志著轉基因非人靈長類技術的誕生。同年7月，Wolfgang 等同樣利用慢病毒載體轉染恒河猴囊胚期胚胎后移植，也得到了在胎盤組織中整合了外源eGFP的轉基因恒河猴。這兩個開創(chuàng)性的工作說明轉基因非人靈長類技術實現(xiàn)了從理想到現(xiàn)實的轉變。他們都選擇綠色熒光蛋白作為轉入的目標基因，其主要目的還是用來探討轉基因非人靈長類技術的可行性。在這些工作發(fā)表7年后，美國佐治亞州亞特蘭大埃默里大學Anthony Chan團隊于2008年報道利用慢病毒轉染技術得到了世界上首批亨延頓舞蹈癥轉基因恒河猴。亨廷頓疾病是一種顯性的神經(jīng)性病變疾病，主要是因為人亨廷頓基因 (HTT) 第一個外顯子中CAG重復擴增，導致表達的亨廷頓蛋白中含有多聚谷氨酰胺，從而引發(fā)運動機能損傷、認知功能退化和精神失調(diào)等一系列病癥，患者發(fā)病10?15年后就會死亡。雖然也有亨廷頓疾病嚙齒類轉基因動物模型，但這些模型都不能很好地模擬亨廷頓疾病在人體的表型特征。在亨廷頓轉基因恒河猴的工作中，作者把人HTT基因的第 一個外顯子上后面鏈接84個CAG重復序列，并把這段重組序列包裝到慢病毒載體中，得到高滴度的慢病毒顆 粒 (滴度>109PFU/mL)。通過卵母細胞透明帶下注射把病毒粒子注射到恒河猴MI期卵母細胞的卵周隙。之后，再通過單精注射讓卵母細胞受精和胚胎移植，成功得到轉基因恒河猴。分析結果顯示轉基因猴不僅表達了外源基因， 而且出現(xiàn)了神經(jīng)纖維網(wǎng)聚集、核內(nèi)含物，同時，表現(xiàn)出肌無力和舞蹈癥等亨廷頓舞蹈癥病人的典型標志表型。作為第一個非人靈長類疾病動物模型，亨廷頓疾病轉基因恒河猴模型的意義之大是不言而喻的。該模型可以讓人們更好、更深入地了解亨廷頓疾病，研究其發(fā)病機制和致病機理，從而研發(fā)出相對應的治療方案和藥物。同時，該模型的建立也證明了構建其他非人靈長類疾病模型的可行性。其后，2009年日本科學家Sasaki等利用絨猴性成熟時間相對較短的特性，通過慢病毒載體轉染技術成功得到了可生殖系傳遞的GFP轉基因絨猴。我國雖然在非人靈長類輔助生殖和轉基因技術上起步較晚，2008 年華東師范大學報道了國內(nèi)首例試管食蟹，這足足比美國晚了24年（第一只試管猴出生于1983年），但經(jīng)過近10年的發(fā)展已經(jīng)逐漸趕上并超過了美國、日本等國，處于領跑地位。
在過表達轉基因猴構建工作上，2010 年中國科學院昆明動物研究所報道了國內(nèi)首例轉基因猴；2016年中科院神經(jīng)科學研究所非人靈長類研究平臺孫強團隊與仇子龍組報道了用慢病毒轉染方法將人的自閉癥相關致病基因MeCP2成功轉入食蟹猴個體得到了多只有類似人類自閉癥表型的轉基因食蟹猴，并利用靈長類研究平臺首創(chuàng)的猴精巢異種移植技術提早得到了轉基因猴的F1代。通過慢病毒載體介導得到的非人靈長類轉基因技術只能完成外源基因的過表達操作，致其應用范圍有限。由于在非人靈長類上還未建立可生殖系整合的猴胚胎干細胞系，因此還不能像通過胚胎干細胞基因打靶操作獲得基因敲除小鼠模型那樣來構建基因敲除猴模型。隨著人工核酸酶技術的出現(xiàn)，尤其是高效的CRISPR-Cas9核酶的出現(xiàn)，使得我們可以跨過非人靈長類無胚胎干細胞用于進行同源重組基因打靶的這一技術障礙，直接通過早期猴胚胎注射用于靶向特定基因的分子核酶對靶基因進行編輯，進而獲得相應靶基因突變的猴模型，這使得非人靈長類基因編輯成為了可能。
2014年，來自昆明理工大學和中國科學院神經(jīng)科學研究所的兩個團隊分別通過受精卵注射靶向食蟹猴Mecp2基因的TALEN質(zhì)粒和mRNA得到了Mecp2 基因突變食蟹猴。 隨后南京大學、南京醫(yī)科大學和昆明理工大學聯(lián)合報道了使用CRISPR/Cas9技術獲得了基因編輯的食蟹猴。該工作通過將針對Ppar-γ、Rag1 和Nr0b1三個基因的5條sgRNA和Cas9 mRNA混合注入食蟹猴受精卵的卵胞質(zhì)并將注射后的胚胎移植到代孕受體，最后得到了Ppar-γ 和 Rag1基因編輯食蟹猴。之后，來自中國的多個實驗室報道了多種不同的基因編輯猴，而日本科學家利用ZFN和TALEN成功獲得了IL2RG基因編輯絨猴。至此，過表達和基因編輯這兩項主要的模式動物構建技術在非人靈長類的主要物種恒河猴、食蟹猴和絨猴上都獲得了成功。
二、如何實現(xiàn)非人靈長類模式動物構建的標準化
然而，慢病毒載體介導外源轉基因通常是以多位點多拷貝整合的方式整合到宿主基因組中，而通過基因編輯技術構建的首建猴個體多數(shù)為嵌合體突變，這導致我們很難得到基因型一致的轉基因或基因編輯首建個體。而這種基因型的多變，也使得我們很難精確地將轉基因或目的基因突變和潛在表型對應起來。因此，利用這些方法得到的首建猴并不能稱之為標準的動物模型。
為了有效解決這一問題，建立基于體細胞核移植的非人靈長類模式動物構建技術成為了必然。這是因為在核移植前，可對體細胞進行轉基因或（和）基因編輯操作以得到含有目的基因修飾的細胞，在將基因修飾后的細胞作為供體核進行核移植，就可得到一批遺傳背景一致的基因修飾克隆動物。然而，這一技術建立的前提是首先攻克非人靈長類的體細胞核移植技術，并得到健康的克隆猴個體。
自1996年，首個體細胞核移植哺乳動物多莉羊出生以來，利用該技術已經(jīng)得到了包括馬、牛、羊、豬和駱駝等在內(nèi)大型家畜，也得到了包括小鼠、大鼠、兔、貓和狗在內(nèi)的多種實驗動物。非人靈長類體細胞核移植的研究工作從2002年就開始有報道，盡管有國內(nèi)外多家機構不斷嘗試，但是這些研究最終都沒有成功得到體細胞核移植來源的克隆猴。2003年，美國匹茲堡醫(yī)學院Schatten教授操作了700枚猴卵，并移植16只受體，沒能得到一只懷孕受體。2007年美國俄勒岡國家靈長類研究中心教授Mitalipov接受采訪時指出，他前后共利用了15000枚卵母細胞用于克隆猴實驗，但得到的最好結果也僅僅是懷孕81天后的流產(chǎn)組織。國內(nèi)外多家頂級實驗室在此領域連續(xù)受挫，使得科學家們逐漸失去了對該領域繼續(xù)攻關的信心。之前的體細胞克隆猴研究之所以一直沒有獲得成功，主要有兩方面的原因。一是非人靈長類體細胞核移植技術要求高，無論是卵母細胞去核還是體細胞的注入，靈長類核移植技術操作難度遠高于目前已經(jīng)成功的其他哺乳動物。二是，克隆胚胎發(fā)育效率低，靈長類體細胞克隆胚胎的發(fā)育效率遠遠低于其他哺乳動物。
為了建立非人靈長類體細胞核移植技術并得到健康存活的克隆猴，中科院神經(jīng)科學研究所非人靈長類研究（蘇州）平臺孫強團隊經(jīng)過多年積累，熟練的掌握并改進了猴體細胞核移植的一系列顯微操作技巧，同時針對多種能夠提升哺乳動物體細胞核移植效率的方法，進行了逐一驗證并篩選得到了可以明顯提升猴體細胞核移植胚胎發(fā)育效率的方法，在聯(lián)合使用組蛋白（H3K9me3）去甲基化酶Kdm4d和去乙?；敢种苿㏕SA的條件下，成功將食蟹猴體細胞克隆胚胎的體外囊胚發(fā)育率從13.8%提升到了44.7%，同時囊胚的質(zhì)量也有了顯著的提高。在此基礎上，以胎猴成纖維細胞為供體細胞，進行了克隆猴胚胎構建和移植，成功得到了世界上首批健康存活 的體細胞克隆猴“中中”和“華華”。此項技術突破為非人靈長類模式動物構建提供了重要的技術支持，被《Cell》 雜志主編Emilie Marcus稱贊為“生物技術領域近20年來的里程碑事件”。
體細胞克隆技術的建立對于開展非人靈長類基因編輯動物模型研究至關重要。首先，在體細胞上可實現(xiàn)復雜的遺傳操作；其次，通過嚴格篩選可去除脫靶；最后，可在一個孕周期（160天）內(nèi)獲得遺傳背景和基因型都一致遺傳修飾猴，這也有效克服了非人靈長類實驗動物無遺傳背景一致的近交系和傳代時間過長的問題，使得非人靈長類遺傳修飾動物稱為真正意義上可以廣泛應用的標準化的模式動物。
三、非人靈長類模式動物的應用前景
針對特定遺傳相關疾病的轉基因動物模型可以讓科學家更好的理解疾病發(fā)生發(fā)展的過程和機制。如在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病和帕金森病的動物模型構建中，由于嚙齒類動物在認知和行為上與靈長類的巨大差異，使其在病理學與行為學特征的模擬以及藥物療效評價等方面都存在著無法彌補的缺陷，這也在一定程度上延緩了神經(jīng)退行性疾病的研究和藥物研發(fā)進程。借助于非人靈長類動物模型來研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病有望在較大程度上彌補這些缺陷。在生殖與健康領域，非人靈長類中的食蟹猴和恒河猴都是有月經(jīng)周期的實驗動物，且其平均周期也是28天，在月經(jīng)周期內(nèi)的生殖相關調(diào)控激素如促卵泡素、促黃體生成素、雌二醇和孕激素等的表達時相和變化規(guī)律與人類高度相似，因此是研究生殖內(nèi)分泌調(diào)控的最理想實驗動物模型。此外，恒河猴和食蟹猴都有較長的青春期，也是用于研究青春期啟動和調(diào)控機制的理想動物模型。
隨著免疫療法在腫瘤患者的治療中產(chǎn)生了非常好的療效，伴隨而來的免疫因子風暴和腦水腫等副作用也成為不可回避的問題，而小鼠模型很難模擬這些病理進程，今年初在cancer discovery上的一篇報道，用恒河猴模型成功模擬了CAR-T處理后的免疫因子風暴和腦水腫癥狀，因此可以預見，在不就的將來非人靈長類模式動物將在這個領域也發(fā)揮重要作用。此外諸如HIV，Ebola，Zika等感染性疾病的防控及疫苗研發(fā)也離不開非人靈長類模式動物，類似糖尿病、高血壓等慢性疾病，發(fā)病時間長，也同樣需要有較長壽命的非人靈長類動物模型。而通過結合基因編輯和體細胞核移植技術構建的標準化的非人靈長類模式動物，必將在這些研究領域發(fā)揮重要做成，從而更好地促進人類健康事業(yè)發(fā)展。
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