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在廣州九龍鎮(zhèn)有一座 “豬賓館”，生活著一群身嬌肉貴的實驗小豬，他們能精準地模擬人類的疾病?？茖W家利用基因“剪刀” CRISPR-Cas9，精準地把人突變的亨廷頓基因“粘貼（敲入）”到豬的亨廷頓基因中，從而使豬得了亨廷頓舞蹈病。

廣東科學家領銜的國際研究團隊經(jīng)過四年努力，首次利用基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9）和體細胞核移植技術(shù)，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬，精準地模擬出人類神經(jīng)退行性疾病。實驗動物基地“豬豬賓館”

該項成果于北京時間3月30日在線發(fā)表在生物學頂尖學術(shù)期刊《細胞》上，該研究為開發(fā)治療亨廷頓舞蹈病的新手段提供了穩(wěn)定、可靠的動物模型，也為培育其它神經(jīng)退行性疾病大動物模型提供了技術(shù)范本和理論依據(jù)。研究將推動我國發(fā)展出大動物疾病模型的醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，也可用于干細胞治療等手段的臨床前評價，最終造福于人類。

中科院院士裴鋼教授在得知該成果發(fā)表后指出，2008年，我們在制定發(fā)育與生殖研究國家重大科學研究計劃"十二五"專項規(guī)劃時,就前瞻性地布局了大型實驗動物模型包括豬和猴的培育內(nèi)容,并在后來的“干細胞國家重大科學研究計劃”中持續(xù)加大經(jīng)費投入。我國在基因編輯猴和克隆猴的研究中相繼取得突破性成果，這次我國科學家在豬的疾病模型研究中又取得重大進展，表明我國在大動物模型的研究中已走在世界前列，將極大地推動我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展。

論文共同通訊作者為暨南大學粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院李曉江教授、中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學研究員、美國Emory大學李世華(Shihua Li)教授。

什么是亨廷頓舞蹈癥　

亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等是當今社會嚴重威脅人類健康的神經(jīng)退行性疾病。這些疾病伴隨年齡漸長而產(chǎn)生、可遺傳、呈漸進性發(fā)展，由于缺乏合適的動物模型進行藥物篩選，目前尚無有效的治療方法。李曉江介紹，神經(jīng)退行性疾病是致病蛋白變異后沉淀在神經(jīng)細胞中，造成神經(jīng)細胞功能紊亂，并引發(fā)神經(jīng)細胞死亡，從而導致疾病發(fā)生。而亨廷頓舞蹈病是由單基因（HTT）突變導致的神經(jīng)退性疾病。

這是一個理想的疾病模式，可用于研究蛋白質(zhì)錯誤折疊如何引起選擇性的神經(jīng)退性病變，是以后研究多基因突變病癥的基礎。尋找合適的疾病實驗模型

小鼠作為最常見的動物模型，已被廣泛地用于研究人類疾病機理和尋找臨床治療方法。李曉江團隊在研究中發(fā)現(xiàn)，表達突變基因的神經(jīng)退行性疾病小鼠模型，并不能表現(xiàn)出像病人腦中一樣的典型神經(jīng)細胞死亡的重要病理特征。許多有治療效果的藥物在小鼠模型中有效，在臨床上對病人往往無效。為了探索動物模型，他開始把目光轉(zhuǎn)移到大動物、非人靈長類動物身上。

早在2008年，“夫妻檔”科學家李曉江、李世華在美國Emory大學合作者的支持下，通過將外源性的突變基因引入到獼猴的體內(nèi)，成功地建立了世界首只轉(zhuǎn)基因亨廷頓病猴模型李曉江說，在該模型中，可以明顯地觀察到相應的病理特征和行為變化，但表達外源性致病基因片段的毒性過強。實驗中的轉(zhuǎn)基因猴子基本在出生后較短時間內(nèi)死亡，同時無法傳代。因此，轉(zhuǎn)基因亨廷頓病猴模型無法達到篩選治療疾病的藥物的目的。

為何選擇豬位于廣州九龍鎮(zhèn)的“豬賓館”，記者看到，科學家們正精心飼養(yǎng)著一群身價不菲的實驗小豬。與果蠅、線蟲、小鼠等小型動物相比，豬被公認為是人類醫(yī)學研究理想的大動物模型。賴良學解釋，豬的心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚、營養(yǎng)需要、骨骼發(fā)育以及礦物質(zhì)代謝等都與人的情況極其相似，豬的體型大小和馴服習性允許進行反復采樣和進行各種外科手術(shù)。

賴良學提到，與非人靈長類動物相比，豬的基因多樣、繁殖周期短、一窩產(chǎn)仔多，便于根據(jù)特殊需要進行選育，又不存在倫理學方面的問題。所以，豬的疾病模型用于做藥物篩選、人類疾病研究、干細胞治療的研究結(jié)果，更容易轉(zhuǎn)化為臨床應用。

作為華南地區(qū)重要的大動物疾病模型實驗平臺之一，賴良學團隊先后建立了20余種在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領域具有重要價值的轉(zhuǎn)基因和基因打靶克隆豬。2010年，這對“夫妻檔”找到了賴良學，一拍即合，他們合作建立了首例轉(zhuǎn)基因亨廷頓病豬模型。

“豬八戒”成為科學家掌中寶

大膽的科學設想

擺在科學家面前的是一個難題，與轉(zhuǎn)基因亨廷頓病猴模型一樣，豬模型也具有明顯的表型特征，但不易存活，無法傳代。這一問題，曾一度令他們感到非常困擾。李世華說，“人是在某個定點基因突變而導致亨廷頓疾病，而目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)是隨機性的將外來的變異基因插入動物的基因組，其表達量也高于內(nèi)源性致病基因。”

團隊進而分析，直接把豬的內(nèi)源性基因改變?yōu)橥蛔兓颍i的病理變化應該與病人的病理狀態(tài)更接近。然而，基因敲入的效率太低，在大動物中很難獲得。2013年，隨著基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9）被廣泛應用于哺乳動物中，在廣東省科技計劃的支持下，他們大膽嘗試這一科學設想，李世華著手應用Cas9技術(shù)來建立亨廷頓基因敲入豬模型。團隊通力合作，利用基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9），將人突變的亨廷頓基因插入到豬的內(nèi)源性亨廷頓基因的表達框中，即人外顯子1中包含150 CAG重復序列精確地插入豬的HTT內(nèi)源性基因中。

能夠成功關鍵還看實驗進展，利用成纖維細胞篩選出陽性克隆細胞，這并非一件易事，“單細胞逐個挑出來并進行篩選及鑒定，一定要挑選狀態(tài)最好的細胞用來胚胎移植”。負責此項實驗工作的閆森先后篩選了上千個細胞，從中挑出確定帶有突變基因且狀態(tài)最好的細胞，閆森說，“每天早上7點進入細胞間，看細胞、換液、不停地跟細胞打交道，一抬頭已是下午3點。好不容易篩選到的陽性克隆細胞如果狀態(tài)不好又得重來，只有大量篩選才能獲得最優(yōu)的細胞克隆。很快，實驗進入下一步，他們運用體細胞核移植技術(shù)進行克隆，成功培育帶有突變基因的新生豬。在歷經(jīng)5個月的觀察后，亨廷頓豬出現(xiàn)了運動障礙等漸進性發(fā)病的表型。下一步就是將穩(wěn)定表達的基因敲入亨廷頓豬繁殖下去。由于疾病模型豬身體狀態(tài)不好，在傳代過程中更需要悉心的照料。終于在團隊的呵護下F1代小豬出生了。為了證明亨廷頓基因敲入豬的病理特征更接近于人類。李世華多次從美國返回國內(nèi)親自指導實驗，到豬場看小豬的生存環(huán)境及生活狀態(tài)。

小心的求證

實驗結(jié)果傳來，他們成功了！其結(jié)果驗證，該模型不但能夠模擬亨廷頓病患者在大腦紋狀體的神經(jīng)元選擇性死亡的典型病理特征，在行為上也表現(xiàn)出類似亨廷頓病“舞蹈樣”的異常行為。難能可貴的是，這些病理及行為學表型都可以穩(wěn)定地遺傳給后代。

作為世界首例亨廷頓病豬基因敲入模型，它表明在模擬病人的神經(jīng)病理變化特別是腦疾病方面，大動物模型比小動物模型更具優(yōu)勢。

“豬八戒”成為科學家掌中寶

為人類試藥 造福于人類

神經(jīng)疾病基因敲入豬的成功，將推動我國發(fā)展出大動物疾病模型的醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，促進針對阿爾茨海默病、帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進程。同時，該動物模型可用于干細胞治療等手段的臨床前評價，最終造福于人類。

從事多年研究亨廷頓病的權(quán)威專家、美國加州大學洛杉磯分校楊向東(X. William Yang)教授指出，亨廷頓舞蹈病基因敲入豬的建立是神經(jīng)退行性疾病研究領域中一個里程碑式的發(fā)現(xiàn)，使科學家能更深入了解神經(jīng)細胞死亡的機制及尋找有效的治療方法。

文章共同第一作者為暨南大學粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院閆森副研究員和涂著池博士、中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院劉朝明。中山大學、吉林大學、云南農(nóng)業(yè)大學的科學家們也參與了該工作。研究工作得到了國家自然科學基金委、國家重大研究計劃、國家重點研發(fā)計劃以及廣東省科技計劃的大力支持。