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編者：資源增量是實驗動物科技發(fā)展的核心任務，是實驗動物對生命科學研究提供支撐和服務的基礎(chǔ)和保 障。自上世紀 80 年代以來，我國老一輩實驗動物科學家苦心孤詣，在實驗動物資源研發(fā)工作中取得的多項開創(chuàng)新成果。

1988年《實驗動物管理條例》發(fā)布實施，在實驗動物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質(zhì)量，推動我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實驗動物資源標準化、新品種/品 系開發(fā)和動物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。

為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國實驗動物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應用成果。

實驗用 SPF 大白豬和長白豬的標準化研究與應用前景

高彩霞 辛暢 陳洪巖

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，哈爾濱，150069）

摘要:標準化 SPF 豬群是生命科學研究的重要支撐條件之一，在畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)實踐中也發(fā)揮著重要作用。 大白豬和長白豬是最普遍的主導瘦肉型商業(yè)品系，在實驗動物方面的研究鮮有報道。本文介紹了 SPF 大白豬和長白豬基礎(chǔ)群的引進，探討了豬群的標準化研究和應用前景，其研究不僅豐富了我國實驗動物資源，也為畜禽 疫病防控技術(shù)研發(fā)提供核心支持。

無特定病原體（Specific pathogen-free, SPF）豬是國際公認的標準化的、重要的高等級大型農(nóng)用實驗 動物，是生命科學研究、生物制品生產(chǎn)的重要實驗材料和原材料，是畜禽疫病防控研究的核心依靠，對于解決在動物疫病發(fā)生、發(fā)展、傳播機制、致病機理研究以及防疫用生物制品研制中的科學問題和關(guān)鍵技術(shù)，保障畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

1、實驗用 SPF 大白豬和長白豬培育的背景

實驗用小型豬已廣泛用于生命科學、醫(yī)藥學、畜禽疫病、人獸共患疫病防控等研究，它是生物制品研發(fā)、 生產(chǎn)檢驗和保證質(zhì)量的實驗動物，是生物檢測的重要工具，是人類醫(yī)學研究的主要模型，是異種器官移植的供體和高品質(zhì)生物制品原料獲取的主要來源[1]。歐、美等發(fā)達國家對 SPF 小型豬的開發(fā)高度重視，建立有完整的 質(zhì)量標準體系，全面的檢測技術(shù)體系，并且建立了嚴格的模型構(gòu)建及評價標準。我國開發(fā) SPF 小型豬群尚面臨 重重困難，主要是因為我國目前尚無高質(zhì)量的 SPF 小型豬基礎(chǔ)群，僅有個別單位保有小規(guī)模的 SPF 豬群。在畜禽疫病防控研究，生物制劑研發(fā)、生產(chǎn)等方面推廣利用度較低，除獲得 SPF 小型豬困難外，現(xiàn)有的部分種群小 型豬抗病性較強、質(zhì)量均一性較差也是重要因素。疫苗研發(fā)、臨床試驗、藥物篩選、病毒感染等研究目前主要使用農(nóng)場或農(nóng)村散養(yǎng)豬，動物遺傳背景雜亂，疫病凈化難度大，抗病性不一，實驗結(jié)果的可靠性大大降低。又 因我國實行強制免疫政策，故獲得疫病防控研究用非免疫（無抗）實驗豬也非常困難，嚴重滯后了畜禽疫病防控的研究進程 [2-3]。因此，建立適合疫病防控研究的非免疫（無抗）實驗豬，特別是 SPF 豬種群非常重要。

大白豬和長白豬是目前世界上使用最普遍的瘦肉型商業(yè)品系，具有生長速度快、繁殖力高、適應性強以及瘦肉率高等優(yōu)良品質(zhì)特性[4]。我國從上世紀五六十年代引進大白豬和長白豬后，一直作為商品化肉用型豬來飼 養(yǎng)，占我國生豬飼養(yǎng)量的 60%以上。因此，開發(fā)其作為疫病防控研究用 SPF 豬非常合適。

開發(fā) SPF 大白豬和長白豬，培育適合我國國情的 SPF 豬種質(zhì)資源，同時建立飼育、管理和質(zhì)量控制標準化技術(shù)，填補 SPF 豬空白，解決實驗用豬瓶頸問題，實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源共享利用，提升動物疫病研究水平，加速生命科學研究和生物制品產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，推動行業(yè)和社會的進步，意義重大。

2、實驗用大白豬和長白豬的引進

2014 年，中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所從加拿大引進純種 SPF 大白豬和長白豬共 100 頭，種母豬各40頭，種公豬各 10 頭，擬對其進行實驗動物標準化培育建立適合我國國情的實驗用 SPF 豬種群。豬群引進后先進行隔離檢疫，對全群豬采血采樣，經(jīng)檢疫部門檢疫，引進豬無豬喘氣病、豬胸膜性肺炎（1,2,5,7,12 型）、萎縮性鼻炎、豬痢疾、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬流感、偽狂犬、虱等動物疫病，達到引進豬的要求。然后將其飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)施達標，符合國家標準（GB 14925-2010）規(guī)定。豬群的飼料和飲水等符合相關(guān)標準和要求，從業(yè)人員取得實驗動物從業(yè)人員上崗資格證，建立實驗豬標準化生產(chǎn)設(shè)施規(guī)章制度和標準操作規(guī)程，取得了實驗動物生產(chǎn)許可證（SCXK（黑）2015-004）。

3、實驗用 SPF 大白豬和長白豬的標準化研究

3.1 遺傳學研究

3.1.1 群體遺傳多樣性

為了研究大白豬和長白豬的群體遺傳多樣性，采用 19 對微衛(wèi)星引物對該群體進行群體遺傳學分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 19 個微衛(wèi)星位點在大白豬群中檢測到 84 個等位基因，長白豬群中檢測到 89 個等位基因。大白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為 0.5271 和 0.5877；長白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為 0.5652和 0.6066。由于 S0155，S0143，S0178，Sw857 和 Sw936 位點內(nèi)等位基因大小和含量差異顯著（P=0.0151）可作為大白豬和長白豬品種鑒定的候選位點。F-統(tǒng)計和遷移率分析結(jié)果表明，群體內(nèi)的分化較小，遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[5]。因此，引進的加系純種大白豬和長白豬的遺傳結(jié)構(gòu)與國內(nèi)部分純種大白豬和長白豬相比更為穩(wěn)定。此外，制定了團體標準《實驗動物 SPF 豬遺傳質(zhì)量控制》（T/CALAS 19-2017）。

3.1.2 母系遺傳結(jié)構(gòu)

分析實驗用大白豬和長白豬的線粒體 DNA 控制區(qū)（D-loop 區(qū)）遺傳多樣性，揭示其母系遺傳結(jié)構(gòu)，同時以我國地方品種巴馬小型豬和融水小型豬為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 107 個樣本中共檢測到 40 個多態(tài)位點，分為 13個單倍型，與地方品種相比，大白豬和長白豬單倍型數(shù)較少，分別含有 3 種和 2 種特有單倍型，只有 1 個共享單倍型 H4。兩豬群中各存在 1 個優(yōu)勢單倍型。單倍型多樣度（Hd）分析，融水小型豬單倍型多樣度最高（0.767），長白豬最低（0.429），大白豬和巴馬小型豬分別為 0.566 和 0.503。表明實驗用大白豬和長白豬種群的單倍型數(shù)較少，各存在 1 個優(yōu)勢單倍型，遺傳多樣性低，具有清晰的母系遺傳結(jié)構(gòu)，有利于進一步的實驗動物標準化以及遺傳質(zhì)量控制研究。

3.2 微生物的凈化

我國 SPF 豬群疫病凈化難度較大，其主要原因之一是我國尚未建立符合我國國情的 SPF 豬標準，已有的標準 GB/T 22914-2008《SPF豬病原的控制與監(jiān)測》主要考慮的是我國養(yǎng)豬業(yè)的現(xiàn)狀，偏向于集約化生產(chǎn)，并未考慮實驗動物化需求，而且頒發(fā)時間較早，有一些地方標準主要是針對我國實驗用小型豬而制定。因此對于SPF 大白豬和長白豬種群的建立，首先參照國外發(fā)達國家 SPF 豬的微生物監(jiān)測，結(jié)合我國病原流行情況以及實際飼養(yǎng)情況，制定了團體標準《實驗動物 SPF 豬微生物學監(jiān)測》（T/CALAS 33-2017）和《實驗動物 SPF 豬寄生蟲學監(jiān)測》（T/CALAS34-2017），制定了黑龍江省地方標準《實驗動物 豬寄生蟲學等級及監(jiān)測》（DB23/T2057.9-2017），規(guī)定排除 9 種病毒病、8 種細菌病和 3 種寄生蟲。根據(jù)制定的標準對加系大白豬和長白豬基礎(chǔ)群進行了 4 次全群監(jiān)測，確定豬群已凈化了 14 種疫病，重要的病毒病均為陰性，微生物質(zhì)量優(yōu)良。

3.3 生物學特性研究

為了分析 SPF 大白豬和長白豬的生殖生理和血液生理生化特性，利用常規(guī)方法測定了豬群 10 項生殖生理指標、19 項血液生理和 18 項血液生化指標，統(tǒng)計分析各指標在不同群體、不同年齡、不同性別間的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn) SPF 大白豬和長白豬生殖生理指標和血液大部分生理生化指標差異不顯著（P>0.05），個別指標如血液生理指標 GRAN、HGB、RDW、PLT、PCT，血液生化指標 ALKP、CHOL、TBIL、BUN 在品種間、不同年齡以及不同性別之間差異顯著（P<0.05），但其偏離正常值范圍較小。SPF大白豬和長白豬在生殖生理和血液生理生化等方面基本穩(wěn)定，與其它實驗用小型豬相比差異不大，為其標準化飼養(yǎng)、動物模型的構(gòu)建以及封閉群豬群遺傳質(zhì)量的評價提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[6]。

3.4 免疫遺傳學研究

3.4.1 SPF 大白豬和長白豬 SLA 單倍型多樣性的分析

為了研究 SPF 大白豬和長白豬的 SLA 單倍型特征，對 15 頭大白豬和 22 頭長白豬擴增 SLA-1、SLA-2、SLA-3、DRB1、DQB1 和 DQA 基因，分析其等位基因序列，發(fā)現(xiàn) 6 個基因共存在 68 個等位基因，其中 3 個為未確定等位基因，3 個 DQA 等位基因為新發(fā)現(xiàn)等位基因。根據(jù)獲得的等位基因建立了 PCR-SSP SLA 分型方法，對 330 頭大白和長白仔豬進行 SLA 分型，共獲得 17 個 SLA I 類、11 個 II 類和 3 個重組 SLA 單倍型。所有的等位基因和單倍型已獲得 ISAG SLA 命名委員官方命名。并利用 MHCcluster 方法分析了 19 個常見 SLA I 類分子特異性結(jié)合肽段的功能性差異，發(fā)現(xiàn)這些分子從功能上明顯地聚為 4 個分支，表明肽結(jié)合基序可分為 4 大類，對實驗動物標準化及其選擇，尤其是雜合子個體作為實驗動物時做出了提示[7-9]。

3.4.2 體外試驗分析不同 SLA-1 分子結(jié)合疫病 CTL 表位的特異性

分別合成 5 個已鑒定的豬瘟病毒（CSFV）（1 個）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）（4 個）CTLs 表位引物，利用 SOE-PCR 技術(shù)在體外構(gòu)建表位-SLA-1 胞外區(qū)-β2m 復合體，利用原核表達系統(tǒng)進行表達，純化和復性，用 ELISA 方法檢測 SLA-1 分子與表位結(jié)合的特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn) SLA-1*13:01、SLA-1*11:10 和SLA-1*11:01:02 蛋白可以特性結(jié)合不同的豬源病毒 CTL 表位，并且鑒定出 5 個已知 CTLs 表位的 MHC 限制性。此外，與 5 個表位都結(jié)合的 SLA-1*13:01 分子 Asn151Val152 突變?yōu)椴慌c表位結(jié)合的 SLA-1*04:01:01 分子相應位置的氨基酸后，SLA-1*13:01 突變等位分子與 5 個表位均不發(fā)生結(jié)合，相反，SLA-1*04:01:01 分子第 151和 152 位氨基酸突變?yōu)?SLA-1*13:01 分子 Asn151Val152 后，突變分子與 5 個表位均發(fā)生了不同程度的結(jié)合。結(jié)合槽三維結(jié)構(gòu)顯示 Asn151Val152 影響 E 口袋大小和性狀，從而影響與表位多肽的結(jié)合。因此固定組合的Asn151Val152 氨基酸可能是影響 CTL 表位特異性結(jié)合 SLA-1*13:01 和 SLA-1*04:01:01 分子的關(guān)鍵氨基酸。這些研究可為不同 SLA 單倍型豬群對疫病的抗性和易感性研究提供依據(jù)[10]。

3.5 豬用隔離器的開發(fā)

開發(fā)了新型豬用隔離器，在豬生活倉與排泄物收集倉之間設(shè)有水平設(shè)置的漏縫地板；該排泄物收集倉的底部為中央向下突出的錐形，在底部的下端設(shè)有排污口；在豬生活倉的頂部設(shè)有空氣過濾器、采光窗和物品傳遞窗；在豬生活倉的下部側(cè)面設(shè)有大顆粒糞便傳遞窗。在隔離器內(nèi)部接近底部的位置安裝漏縫地板，在隔離器外側(cè)安裝專用的大顆粒糞便傳遞窗，其底邊略高于漏縫地板。這樣的設(shè)計可以在除糞時將豬的大顆糞便利用隔離器內(nèi)的鐵鍬從專用的傳糞窗傳出，小的糞便及尿液則從漏縫地板落下，經(jīng)排污管排出，解決了豬糞便經(jīng)常堵塞排污管的問題，也改善了豬的衛(wèi)生環(huán)境，大大減少了沖水量，降低了糞尿混合滋生細菌的風險，已獲得了實用新型專利。

4、實驗用 SPF 大白豬和長白豬的應用前景

4.1 用于重大疫病防控研究

SPF 大白豬和長白豬，已凈化了 14 種病原，且遺傳分化較小，遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定， 可大量應用于重大動物疫病致病機理、免疫機制及防控技術(shù)研究，如豬瘟、高致病性藍耳病、口蹄疫等重大疫病病原學、病原遺傳變異與分子進化、診斷與監(jiān)測技術(shù)以及新型疫苗研制等。還可利用其優(yōu)勢研究影響培育的重要傳染病病原的宿主關(guān)鍵分子，為改造特定 SPF 豬資源的培育提供修飾靶點，進而運用基因修飾技術(shù)建立抗病性較強的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炗秘i新品種和品系。標準化 SPF 大白豬和長白豬的培育將對保障我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展與疫病有效防控提供強有力的技術(shù)支撐，也可加快多種嚴重危害畜牧業(yè)的烈性病研究，從而加強相關(guān)的疫病防控工作[11]。

4.2 用于生物制品研發(fā)、生產(chǎn)和檢驗研究

微生物質(zhì)量優(yōu)良、遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的 SPF 大白豬和長白豬的標準化培育對提高傳統(tǒng)疫苗產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量、研制新型高效疫苗、發(fā)展獸用疫苗產(chǎn)業(yè)、滿足獸醫(yī)生物制品和人用疫苗研發(fā)、生產(chǎn)與檢驗中對大量標準化實驗用豬的需求有重要意義[12]。同時可用作高品質(zhì)生物制品原料獲取的主要來源，如提供合格的高品質(zhì) SPF 豬陰性血清，促進豬病相關(guān)的基礎(chǔ)研究、檢測方法的建立，也是動物源性生物醫(yī)用材料的主要來源。

4.3 用作人類醫(yī)學研究的主要模型

豬在解剖學、生理學、疾病發(fā)生機理等方面與人相似，目前已被廣泛運用于心血管病、糖尿病、皮膚燒傷、血液病等多方面研究，在生命科學研究領(lǐng)域中具有重要的應用價值，同時也在人用疫苗的研發(fā)和評價中同樣發(fā)揮著不可替代的作用[13]。加系 SPF 大白豬和長白豬，生物學特性如生殖生理和血液生理生化方面基本穩(wěn)定，部分血液生理生化指標與人相似，可以作為人類醫(yī)學研究的替代模型，如利用 SPF 豬遺傳背景清晰且遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的優(yōu)勢研究先天性遺傳性疾病，提高研究結(jié)果的準確性和可靠性。

4.4 用作異種器官移植的供體

由于豬是人類異種器官移植的重要來源，可為人類開展異種器官移植和生物材料提供充足的供體材料[14-15]。異種移植時，由于供體豬種屬差異，受體對豬的器官會發(fā)生強烈的免疫排斥反應。SLA是引起豬-人異種器官移植急性細胞性排斥的遺傳因素之一[16]。以不同 SLA 單倍型豬為供體進行異種器官移植后，移植效果存在明顯差異。明確不同豬品種的 SLA 單倍型特征對豬-人異種器官移植 MHC 配型的研究具有重要的意義。加系 SPF大白豬和長白豬已經(jīng)進行了 SLA 單倍型特征分析，發(fā)現(xiàn)了 62 個 SLA 等位基因，分別組成了 17 個 I 類和 11 個II 類單倍型，具有高度的多樣性，具有潛在的器官移植價值。

標準化SPF大白豬和長白豬的培育在生命科學、醫(yī)療衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)、新藥研發(fā)與安全評價、食品安全等領(lǐng)域中具有十分重要的地位和作用。它是重要的動物遺傳資源，不僅可以豐富實驗動物資源，也可為畜牧業(yè)提供良種資源。我國在 2017 年國家重點研發(fā)計劃重點專項和 2018 年國家自然基金中均設(shè)立和資助了SPF豬培育相關(guān)的項目，表明我國已經(jīng)將 SPF 豬的培育列入了重點研究范疇。開展其培育和應用研究將在畜禽疫病防控、畜禽種業(yè)創(chuàng)新、器官移植、醫(yī)學模型創(chuàng)制和公共衛(wèi)生風險防范等方面發(fā)揮巨大的潛力。