編者：資源增量是實驗動物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實驗動物對生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保障。自上世紀80 年代以來，我國老一輩實驗動物科學(xué)家苦心孤詣，在實驗動物資源研發(fā)工作中取得的多項開創(chuàng)新成果。
1988 年《實驗動物管理條例》發(fā)布實施，在實驗動物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質(zhì)量，推動我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實驗動物資源標準化、新品種/品系開發(fā)和動物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國實驗動物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應(yīng)用成果。
融水小型豬的標準化與應(yīng)用
唐小江1,2 施赫赫2
（1.珠海百試通生物科技有限公司，珠海，519040）（2.廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，佛山 528248）
摘要融水小型豬的種源來自廣西融水縣苗寨，2012 年5 月被引種到廣東，課題組將其建立基礎(chǔ)群繁育至今。期間對該豬種的種質(zhì)特性、線粒體DNA 結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化、體重與體尺、血常規(guī)、血生化與電解質(zhì)指標、主要臟器及自發(fā)性病變組織學(xué)、群體遺傳結(jié)構(gòu)等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進行研究。參照北京地方標準，在飼養(yǎng)繁育過程中初步建立了融水小型豬微生物與寄生蟲、環(huán)境與設(shè)施、飼料、病理學(xué)、遺傳學(xué)等質(zhì)量控制標準。上述研究表明融水小型豬是中國傳統(tǒng)豬種中比蘭嶼豬更為古老的豬種，能適應(yīng)廣東當(dāng)?shù)貧夂?，繁殖良好，體型小，性情溫馴，通過標準化的飼養(yǎng)管理與質(zhì)量控制，具有培育成實驗用小型豬的基本條件。融水小型豬應(yīng)用于世界首例亨廷頓舞蹈癥基因敲入豬的成功研究，說明在科研應(yīng)用上具有一定的價值。
我國具有豐富的小型豬資源，數(shù)十家機構(gòu)對近10 種小型豬開展了實驗動物化研究，培育出五指山小型豬、版納微型豬、貴州小型豬、巴馬小型豬、中國農(nóng)大小型豬、西藏小型豬、蕨麻小型豬等實驗用小型豬[1-7]。本課題組在廣西融水縣苗寨發(fā)現(xiàn)了一種體型小、性情溫馴的小黑豬。課題組于2012 年5 月將該品種引種到廣東佛山三水樂平鎮(zhèn)的小型豬基地進行實驗動物標準化研究。現(xiàn)將系列研究情況及應(yīng)用作一概述。
1、融水小型豬的來源
融水小型豬的種源來自廣西壯族自治區(qū)融水縣桿洞鄉(xiāng)百秀村苗寨。該豬在當(dāng)?shù)乇环Q為“香豬”、“大苗山香豬”、“苗豬”、“融水黑香豬”等。該苗寨地處崇山峻嶺之中，交通十分不便，因此該豬是近親繁殖，基本沒有引入外來基因，經(jīng)過數(shù)千年繁育，遺傳性狀穩(wěn)定，屬于自然形成的典型封閉群。
2、引種、繁育、標準化管理
2010 年，基于當(dāng)時尚無該豬種質(zhì)資源特性的研究報道的情況，本課題組決定引進該豬種，希望通過實驗動物化，將該豬種馴化成醫(yī)學(xué)實驗小型豬并推向科研市場。2010 年～2012 年, 課題組在三水樂平鎮(zhèn)選好豬場場址，興建起小型豬豬舍。2012 年5 月，從融水縣開始分批引進融水豬。經(jīng)過4 次引種，在2012 年12 月，成功建立了基礎(chǔ)種群130 頭（F0 代），其中公豬10 頭，母豬120 頭。當(dāng)月開始，對F0 代種豬進行配種繁育。經(jīng)過約4 個月的時間，F(xiàn)0 代母豬基本完成第一次配種。至2014 年3 月，F(xiàn)1 代母豬約保有570 頭，公豬約保有510 頭。
在此期間，以實驗用小型豬北京地方標準（DB11/T 828.1、2、5、6-2011）作為參考依據(jù)，進行繁育管理，定期進行免疫接種和驅(qū)蟲，并進行檢測。依據(jù)標準定制生長料，哺乳料及維持料，開食料則采用廠家提供的教槽料。環(huán)境及設(shè)施方面，為融水小型豬建造封閉式豬舍，門窗加裝防蚊紗窗，防鼠擋板。利用濕簾通風(fēng)系統(tǒng)和局部保溫?zé)艨刂粕醿?nèi)溫濕度。排污采用環(huán)保處理，設(shè)計為雨水與糞尿污水分流。
建立融水小型豬的譜系記錄，用于查明豬群血統(tǒng)關(guān)系，近交的有無和程度。融水小型豬采用橫式系譜格式記錄，豬只編號規(guī)則為公司代號+出生年月+當(dāng)月第X 窩+每窩第X 只+性別，如B13040906M，表示廣東貝格生物科技有限公司小型豬基地2013 年4 月出生的第9 窩的第6 只，為雄性。示例見圖1，每一組為1 只公豬配2只母豬。
由于實驗用小型豬封閉群的建立需要至少4 代[8]，實驗動物化的過程長，投資大，在資金遇到困難的情況下，2015 年課題組決定將F1 代種豬進行少量活體保種至今。
3、融水小型豬種質(zhì)特性
3.1 體型外貌
融水小型豬體型外貌見圖2。該豬體軀矮小，被毛全黑，少量有唇白和肢端白。頭較大，面平直，額面有縱行皺紋，耳較小薄，略向前伸，稍下垂或兩側(cè)平伸。頸部短而細，背腰平直或微凹，腹較大下垂但不拖地，尾巴細長。母豬乳頭多為5～6 對，少量能達到7 對。后軀豐滿，四肢短細緊湊，肢端常見為臥系[9]。
3.2 繁殖性能
母豬發(fā)情癥狀明顯，一個情期的自然交配受孕率較高，約88. 3%；引進母豬配種后妊娠期平均112 d，初產(chǎn)平均胎產(chǎn)仔6.1 頭，活仔數(shù)5.9 頭；經(jīng)產(chǎn)平均產(chǎn)仔7.9 頭，活仔數(shù)5.9 頭。仔豬45～60 天齡斷奶[9]。
4、標準化研究
4.1 線粒體DNA 結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化的分析
2012 年8 月，選取了全基因組鳥槍法的測序策略對F0 代雌性融水小型豬的外周血液樣本進行測序，使用Illumina 基因組分析測序技術(shù)構(gòu)paired-end 文庫進行末端測序，最后進行拼接及分析。結(jié)果顯示融水小型豬的完整線粒體序列呈環(huán)形，總長為16888 bp，由13 個編碼蛋白基因、22 個轉(zhuǎn)運RNA 和兩個核糖體RNA 構(gòu)成。線粒體DNA 的GC 含量約為44 %。通過系統(tǒng)進化分析、遺傳多樣性分析和中性檢驗，證明在融水小型豬、蘭嶼豬、海南野豬和滇南7 號這一類群中，發(fā)生了種群擴張。該項研究表明融水小型豬是中國傳統(tǒng)豬種中比蘭嶼豬更為古老的小型豬[10]。
4.2 F1 代體重和體尺
2013 年至2014 年，選取第一胎的F1 代融水小型豬83 頭( 雌性48 頭，雄性35 頭) ，測定初生至12 月齡的體重、體長、體高、胸圍、胸寬、胸深、管圍、腿圍、嘴裂長度共9 個生長發(fā)育指標，并應(yīng)用SPSS 統(tǒng)計軟件和Logistic 非線性生長模型進行分析。結(jié)果顯示融水小型豬F1 代的初生體重雌雄分別為0. 61 ± 0. 14kg 和0. 55 ± 0. 13 kg，6 月齡體重雌雄分別為17. 21 ± 5. 20 kg 和16. 35 ± 5. 23 kg，12 月齡體重雌雄分別為26. 97 ±6. 49 kg 和26. 53 ± 5. 65 kg。雌雄比較，9 項指標所測結(jié)果接近，除了初生體重和體長、10 月齡胸寬有差異( P＜0. 05) ，其余指標同月齡雌雄之間均無明顯差異。應(yīng)用Logistic 模型分析，體重生長拐點在5～6 月齡間，體長和腿圍生長拐點在2～3 月齡間，體高、胸圍、胸寬、胸深、管圍和嘴裂長度的生長拐點在1～2 月齡間。從各性狀生長拐點月齡可看出，融水小型豬生長發(fā)育規(guī)律先骨骼，后肌肉和脂肪。該項研究表明融水小型豬F1 代成年體重輕，性情溫順，具備培養(yǎng)成實驗用小型豬基本條件[11]。
4.3 F1 代血常規(guī)、血生化與電解質(zhì)指標
2014 年，選取4 月齡F1 代融水小型豬85 頭，其中雌性43 頭、雄性42 頭；選取12 月齡F1 代融水小型豬36 頭，雌雄各半。頸靜脈采血，分析血常規(guī)、血生化與電解質(zhì)等22 項指標。結(jié)果顯示融水小型豬相同月齡時，兩性別的血常規(guī)指標、血生化和電解質(zhì)的大部分指標差異不大，但同性別在不同月齡之間的部分指標差異明顯。12 月齡比4 月齡融水小型豬，血常規(guī)指標中的白細胞數(shù)、血小板數(shù)下降，血紅蛋白含量升高( P＜0. 05) ，而紅細胞數(shù)變化不大( P＞0. 05) ; 血清ALT、AST、ALP、CK(雄性) 、LDH(雄性) A/G、BUN、GLU（雌性）、CHOL(雄性) 和K+下降( P＜0. 05) ; 血清總蛋白、TBIL、CR、Ca2+升高( P＜0. 05) ，而血清CHOL(雌性) 、TG，HDL-C，LDL-C 變化不大。有19 項生化、電解質(zhì)指標在或接近人類正常值范圍，占86. 4%( 19 /22)。從該項研究獲得的資料看，融水小型豬的血常規(guī)、血生化和電解質(zhì)指標多數(shù)接近人類，數(shù)據(jù)標準差小，且月齡變化與人類相似，部分指標顯著優(yōu)于哥廷根等小型豬，提示融水小型豬具備培育成實驗用小型豬的優(yōu)越條件[12]。
4.4 F1 代主要臟器及自發(fā)性病變組織學(xué)觀察
2014 年，選擇6 月齡F1 代小型豬雌雄各兩頭，麻醉后測體重，進行大體解剖，頸動脈取血測定全身血量、血漿量，記錄脊柱數(shù)量和恒齒齒式，取出主要臟器進行拍照、稱重及測量，切取臟器的部分組織，用福爾馬林固定后做組織切片，在顯微鏡下觀察并拍照，獲得了融水小型豬的29 個臟器形態(tài)圖片、組織學(xué)顯微圖片、主要臟器重量、臟器系數(shù)及其他基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。各臟器組織外觀未見明顯病理異常，僅肺顏色有點暗紅；組織學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)，肺臟細小支氣管周淋巴細胞浸潤，其他器官均為正常，未發(fā)現(xiàn)病理性變化。由于融水小型豬在普通級環(huán)境下飼養(yǎng)，而呼吸系統(tǒng)各器官屬于管腔器官，容易與空氣中物理性、化學(xué)性物質(zhì)如粉塵、氨氣等接觸，刺激引起小支氣管、細支氣管的病理變化。另外，小支氣管、細支氣管黏膜細胞浸潤，存在病原體影響的可能性。在融水小型豬的肺臟組織切片中，只發(fā)現(xiàn)小支氣管、細支氣管周圍淋巴細胞浸潤，肺內(nèi)未發(fā)現(xiàn)塵細胞，其他結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)病理性變化，這也說明了飼養(yǎng)環(huán)境中的刺激因素比較小，或者病原體對肺臟的影響較小。該項研究表明，使用的融水小型豬總體健康狀況良好，其組織器官外觀正常，組織切片檢查基本正常，可以作為融水小型豬病理性檢查的正常組織切片參考依據(jù)[13]。
4.5 微衛(wèi)星DNA 標記技術(shù)對融水小型豬群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析
2015 年，選用北京市地方標準封閉群實驗用小型豬的遺傳質(zhì)量監(jiān)測提供的25 個微衛(wèi)星位點[8]對小型豬研究基地30 頭F1 代融水小型豬基因DNA 進行PCR 擴增，對擴增產(chǎn)物進行STR 掃描，運用popgene32 軟件對該融水小型豬進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。試驗所選取的30 頭F1 代融水小型豬個體年齡在1 年到3 年之間，樣本選擇盡可能避免親緣關(guān)系較近個體，基本能夠反應(yīng)目前融水小型豬群體的總體遺傳概況。結(jié)果顯示，融水小型豬F1 代群體平均觀測等位基因數(shù)為9. 4400，平均有效等位基因數(shù)為5. 2966，說明群體非近親繁殖，基因較穩(wěn)定。平均香隆指數(shù)為1. 8085，是屬理想范圍，這也與微衛(wèi)星多態(tài)性豐富的數(shù)據(jù)分析結(jié)果相吻合。平均有效雜合度為0.7737。一個理想封閉群的平均有效雜合度在0.5～0.7，該試驗的平均有效雜合度略偏高，這可能與種源個體來源，及該種群引入后第一代采用分組交配方式繁殖，封閉繁育代數(shù)較少，還未形成封閉群相關(guān)，同時說明建立融水小型豬封閉群還需進一步培育、繁殖[14]。
5、應(yīng)用成果
新浪科技報導(dǎo)，2018 年3 月30 日，生物學(xué)頂尖學(xué)術(shù)期刊《Cell》在線發(fā)表，我國科學(xué)家領(lǐng)銜的國際研究團隊首次利用基因編輯技術(shù)和體細胞核移植技術(shù)，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈癥基因敲入豬（HD KI Pig）。“HD KI Pig”能精準地模擬人類神經(jīng)退行性疾病——亨廷頓舞蹈病，為我國腦科學(xué)與類腦研究提供了最新手段，也標志我國大動物模型研究走在了世界前列[15]。在此項研究中，融水小型豬為科研作出了貢獻。研究者利用了雌性融水小型豬的胚胎成纖維細胞培育出F0 代亨廷頓舞蹈癥基因敲入豬，并將雌性F0 代豬與野生型的雄性巴馬小型豬交配，培育F1 代豬（融水/巴馬）。雄性的F1 代基因敲入豬與野生型雌性巴馬小型豬交配，生產(chǎn)F2 代豬。通過這種繁育方式，在過去兩年內(nèi)共生產(chǎn)出15 只F1 代豬和10 只F2 代豬，均為陽性[16]。
6、小結(jié)
回顧對融水小型豬的引種、繁育、管理及標準化研究的整個歷程，本課題組深深體會到，雖然融水小型豬兼具體型小、性情溫馴的難得的優(yōu)點，具有很大的發(fā)展前景，但小型豬的研究與標準化是一個資金投入大，市場需求尚不明確，回報慢的項目。盡管本課題組已經(jīng)對融水小型豬的研究和標準化方面做了部分基礎(chǔ)性工作，但離建立起符合標準化的實驗用小型豬種群的目標仍然任重而道遠。我們希望能進一步與有關(guān)企業(yè)及科研院所開展合作，讓融水小型豬這個十分難得的品系能盡快完成實驗動物化、市場化，發(fā)揮其重要的應(yīng)用價值。
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