編者：資源增量是實驗動物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實驗動物對生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保障。自上世紀(jì)80 年代以來，我國老一輩實驗動物科學(xué)家苦心孤詣，在實驗動物資源研發(fā)工作中取得的多項開創(chuàng)新成果。
1988 年《實驗動物管理條例》發(fā)布實施，在實驗動物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質(zhì)量，推動我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實驗動物資源標(biāo)準(zhǔn)化、新品種/品系開發(fā)和動物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國實驗動物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應(yīng)用成果。
實驗用果蠅的標(biāo)準(zhǔn)化
倪健泉
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系
黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）是100 多年前由Thomas Hunt Morgan 引入，作為模式生物進行科學(xué)研究的(Morgan, 1910)。此后，隨著遺傳學(xué)方法的發(fā)展，果蠅引領(lǐng)了許多生物學(xué)新發(fā)現(xiàn)(Bellen et al., 2010)。
如今，果蠅已經(jīng)被廣泛用于各個生物學(xué)領(lǐng)域，包括人類疾病和治療方法的研究(Pandey and Nichols, 2011)。
一、果蠅的主要生物學(xué)特性
1、基本生物學(xué)特性
果蠅成蟲身長約2-2.5mm，雌性約重1.4mg，雄性約重0.8mg(Ong et al., 2015)。在10℃-30℃溫度區(qū)間果蠅可以生存，溫度越高，其生命周期越短(賀爭鳴等, 2016.5)。25℃培養(yǎng)條件下，果蠅生命周期（從胚胎發(fā)育到成蟲）約10 天，其中胚胎、幼蟲、蛹分別經(jīng)歷約1d、5d、4d(張鵬飛，毛玉蕊，楊繞華，孟琳琳，王進忠，魏艷敏, 2010)。羽化后24 小時內(nèi)果蠅即可交配，交配后雌果蠅每天可產(chǎn)卵達100 枚。條件適宜、營養(yǎng)充足的情況下，果蠅壽命可達2-3 個月。
2、果蠅的飼養(yǎng)和遺傳學(xué)操作
根據(jù)日常需要，果蠅可飼養(yǎng)于培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶中，底部放置玉米面、白糖、瓊脂、抗生素等制備的培養(yǎng)基(王霞，喬歡歡，潘麗霞，任興杰，孫錦，徐榮剛，劉魯萍，賀爭鳴，倪建泉, 2016)。由于目前尚無有效的冷凍并復(fù)蘇成蟲或幼蟲的方法，因此世界上各大果蠅資源中心以及1800 多個果蠅實驗室的種質(zhì)資源保存都采用持續(xù)將成蟲轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基的方法。實驗室種質(zhì)保存可將果蠅飼養(yǎng)于18℃、60%濕度、12h/12h 交替光照的培養(yǎng)箱或房間，則其生命周期可達20 天左右，可一個月傳代一次。實驗用果蠅飼養(yǎng)于18℃/25℃/29℃、60%濕度、12h/12h 交替光照的培養(yǎng)箱或房間，可利用不同溫度實現(xiàn)不同實驗?zāi)康模ɡ缈刂艷al4 表達量、控制Gal80ts 表達等）。實驗完成后，將廢棄果蠅連同培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶放入-20℃冰箱冷凍過夜，保證果蠅全部死亡后，可作為普通實驗垃圾處理。
進行遺傳學(xué)操作時，傳統(tǒng)方法是使用乙醚或乙醚與乙醇混合物將果蠅麻醉后再進行，但是存在麻醉效果不好、昏迷時間短、復(fù)蘇率低、對人體安全性差等問題。目前大部分果蠅實驗室采用高壓二氧化碳氣體，經(jīng)過減壓閥處理后，通過麻醉槍和通氣麻醉平板進行果蠅麻醉處理。同時配套使用壁式加濕系統(tǒng)對二氧化碳進行預(yù)加濕，避免操作過程中靜電的影響。該方法操作簡單，對果蠅無傷害，且去除二氧化碳后果蠅復(fù)蘇迅速。
3、果蠅基因組及染色體
果蠅是最好的遺傳學(xué)研究工具之一。一方面，果蠅基因組僅由四條染色體組成，遺傳學(xué)操作簡單；而且果蠅基因組已經(jīng)全部進行了測序和注釋(Adams et al., 2000)，遺傳背景清楚。另一方面，果蠅擁有成熟、強大的遺傳學(xué)工具體系和品系資源，比如Gal4/UAS 系統(tǒng)、嵌合體技術(shù)、近年來發(fā)展起來的基因組編輯和基因激活技術(shù)，以及轉(zhuǎn)基因干擾品系資源庫等，這是其他模式生物望塵莫及的。果蠅基因組編碼14000 多個基因，其中95％的基因集中在X、Ⅱ和Ⅲ號染色體上(Emameh et al., 2015; Ong et al., 2015)。這些基因與人類高度同源：50%以上的果蠅基因與人類同源，而75%以上的人類致病基因能在果蠅中找到同源物(Emameh et al.,2015; Sun et al., 2013)。果蠅基因不僅與人類基因序列保守，功能上也具有非常高的相似性。比如，參與基因表達和代謝調(diào)節(jié)的許多果蠅蛋白質(zhì)與人類對應(yīng)物具有密切的相似性。此外，基因組分析顯示，果蠅中很多重要生化途徑的生物合成網(wǎng)絡(luò)與人類具有良好的對應(yīng)關(guān)系(Ong et al., 2015)。一百多年以來，利用果蠅進行生物醫(yī)學(xué)研究做出了許多開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，例如干細胞微環(huán)境的概念最初就是在果蠅中提出的。
二、實驗用果蠅的要求
實驗用果蠅一般需從國際公認的果蠅資源中心訂購，如美國的Bloomington Drosophila Stock Center、日本的NIG、以及我國的清華大學(xué)果蠅中心，以保證基因型正確、遺傳背景清晰、無微生物（細菌、霉菌、螨蟲等）污染。引入果蠅后，需對果蠅的表型進行確認，必要時可結(jié)合PCR、測序等方式進一步確認。此外，將果蠅飼養(yǎng)于合適溫度和濕度條件，保證其長勢良好。使用前，需要經(jīng)過正規(guī)的隔離檢查，保證無污染后方可放入實驗室正式使用。我國目前尚無針對實驗用果蠅的技術(shù)規(guī)范和明確規(guī)定，相關(guān)規(guī)定參照國家檢驗檢疫總局發(fā)布和實施的《實驗動物引種技術(shù)規(guī)程》和《實驗動物質(zhì)?？刂埔蟆返任募?。
三、實驗用果蠅的應(yīng)用研究
果蠅飼養(yǎng)容易、生命周期短，與其他短世代模型生物相比，卻擁有更多的組織和細胞類型，以及豐富的、方便觀察的表型和個體行為，因此為生命發(fā)育、成體健康、個體行為甚至進化等科學(xué)問題的探索提供理想的材料。此外，百余年來積累的遺傳學(xué)方法和資源為眾多生物過程的研究提供了巨大的便利。利用果蠅進行的研究使我們在遺傳學(xué)、細胞和發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和行為學(xué)、分子生物學(xué)、進化學(xué)和人口遺傳學(xué)，以及其他領(lǐng)域取得了長足的進步(Hales et al., 2015)。
利用模式生物進行生命科學(xué)研究的最終目的是服務(wù)人類，幫助預(yù)防和治療人類重大疾病。果蠅不僅在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域至關(guān)重要，加深了我們對于眾多生物過程中信號通路和分子機制的理解，而且在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也為人類疾病的干預(yù)策略提供了重要的參考依據(jù)。利用果蠅，研究人員建立了許多人類重大疾病模型，并用于探究發(fā)病機理和治療措施。例如，隨著老年人口比例增加，全世界神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率逐年增加，給家庭和社會帶來巨大的負擔(dān)。針對此問題，通過過表達人源顯性可遺傳疾病基因，建立了一系列神經(jīng)退行性疾病的果蠅模型，包括阿爾茲海默癥、帕金森綜合征和亨廷頓舞蹈癥。這些疾病模型不僅能夠在組織和細胞水平上模仿人類的主要病理特征，還能通過幼蟲和成蟲的嗅覺學(xué)習(xí)、求偶、攻擊和晝夜節(jié)律等行為從系統(tǒng)水平模擬人類神經(jīng)退行性疾病的功能退化(Fernandez-Funez et al., 2015; Rincon-Limas et al., 2012)。利用這些模型進行的研究，不僅加深了人們對于疾病發(fā)生發(fā)展過程的理解(Bodai et al., 2012; Campesan et al., 2011; Fernandez-Funezet al., 2015; Varga et al., 2014)，而且為探索疾病的治療方法做出了巨大的貢獻(Jansen et al., 2014;McGurk et al., 2015)。
除了神經(jīng)退行性疾病，在果蠅中建立模型并進行深入研究的人類疾病還有免疫類疾病如哮喘、病原菌感染疾病、金屬中毒等(Calap-Quintana et al., 2017; Lestradet et al., 2014; Roeder et al., 2012)，代謝類疾病如肥胖及糖尿病、高糖飲食引發(fā)的心血管疾病等(Na et al., 2013; Teleman et al., 2012)，腫瘤如眼睛腫瘤、腸道腫瘤、卵巢腫瘤等(Bennett et al., 2015; Eliazer et al., 2011; Kirilly and Xie, 2007;Markstein et al., 2014; Richardson and Portela, 2018; Song and Lu, 2011; Sonoshita and Cagan, 2017;Yang et al., 2017)，以及衰老、皮膚病等其他疾病研究(Bohnekamp et al., 2015; Brandt and Vilcinskas,2013)。果蠅疾病模型不僅可以在細胞和分子水平上很好地模擬人類發(fā)病機制，而且利于進行行為學(xué)觀察和統(tǒng)計學(xué)分析，其強大的遺傳學(xué)工具和品系資源更是為揭示參與疾病的基因、信號通路、開發(fā)疾病治療方法并應(yīng)用到人類提供了極大的便利。
四、實驗用果蠅種群的建立與意義
近二十年來基因組學(xué)的發(fā)展一方面使人們得到了各物種全基因組序列，另一方面對于這些零碎化的基因序列及其功能的認識和解讀卻遠遠不足。作為研究最深入的多細胞生物和可靠的人類疾病模型，果蠅中表型明確的基因也僅僅占其基因組編碼基因的約15%(Perkins et al., 2015)。因此，大量功能未知的基因和信號通路及其相互之間的作用關(guān)系仍需我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>
百余年來，果蠅在各生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究經(jīng)久不衰，除了其自身生物學(xué)特性外，最突出的優(yōu)勢便是一百年來果蠅研究積累的強大的遺傳學(xué)工具及品系資源。例如，轉(zhuǎn)基因RNAi 技術(shù)的出現(xiàn)使得我們可以及其便利地實現(xiàn)體內(nèi)單個基因的表達調(diào)控。為了更加便利地實現(xiàn)全基因組任何一個基因的表達調(diào)控和研究，果蠅全基因組水平的轉(zhuǎn)基因RNAi 品系也應(yīng)運而生，它們存在于奧地利的VDRC（http://stockcenter.vdrc.at/control/main）、日本的NIG（http://www.shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/index.jsp）、美國的BDSC（https://bdsc.indiana.edu/index.html）和中國的THFC（http://fly.redbux.cn/）。這些品系涵蓋了絕大部分果蠅基因，能夠滿足大部分研究人員需要。以BDSC 為例，她擁有11000 多個基因的轉(zhuǎn)基因RNAi 品系，覆蓋了71%的果蠅編碼基因(Perkins et al., 2015)。在RNAi 品系的技術(shù)原理方面，VDRC 和NIG 主要是利用前兩代果蠅轉(zhuǎn)基因RNAi 技術(shù)構(gòu)建的長鏈RNA 干擾品系，BDSC 主要是利用第三代轉(zhuǎn)基因RNAi 技術(shù)構(gòu)建的短鏈發(fā)卡RNA 干擾品系。清華果蠅中心（THFC）在原有8000 余株從TRiP 引進的品系外，又利用自主研發(fā)的新一代轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)構(gòu)建了3000 余株與人類高度同源基因及重大疾病基因的新轉(zhuǎn)基因干擾品系（Qiao Huanhuan etal., Nature Communications, accepted）。與原有前三代RNAi 技術(shù)構(gòu)建的品系相比，這些新品系降低了與Gal4 雜交前的本底表達，提高了RANi 誘導(dǎo)后的基因敲低效率，并且實現(xiàn)了一次性敲低多個基因，因此尤其適合那些高表達、高拷貝的基因以及蛋白質(zhì)復(fù)合體的研究。
近幾年來，基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)及基因轉(zhuǎn)錄激活技術(shù)有了長足的進步，使得果蠅基因表達調(diào)控方式更加多元化，為基因功能的研究提供了新的選擇。其中，基于CRISPR/Cas9 的基因編輯技術(shù)可以實現(xiàn)高效的基因突變、插入和同源重組(Ren et al., 2013; Ren et al., 2014a; Ren et al., 2014b)。清華大學(xué)果蠅中心與哈佛醫(yī)學(xué)院合作研發(fā)的CRISPR/dCas9 介導(dǎo)的VPR 及系列flySAM 系統(tǒng)，可實現(xiàn)高效的基因原位激活。隨著果蠅遺傳學(xué)新技術(shù)的不斷更新，配套的全基因組果蠅品系資源也成為新的迫切需求。實際上，將Gal4/UAS 系統(tǒng)與CRISPR/Cas9 技術(shù)結(jié)合，可以實現(xiàn)組織特異性的基因敲除或基因激活，并且其特異性單純地由sgRNA 決定，因此適用于高通量、全基因組的基因增強品系的構(gòu)建(Ewen-Campen et al., 2017; Jia et al.,2018; 徐榮剛，王霞，王芳，孫錦，毛德才，喬歡歡，賈豫，朱芮葆，彭娉，劉魯萍，倪建泉, 2018)。
目前，哈佛醫(yī)學(xué)院TRiP 中心正在陸續(xù)構(gòu)建覆蓋全基因組的基因突變和基因激活的sgRNA 品系，通過與阻止特異性Gal4 雜交，即可在后代果蠅中實現(xiàn)高效的基因突變或激活（https://fgr.hms.harvard.edu/trip-crispr-toolbox-fly-stocks）。不久的將來，研究人員將可以通過BDSC 果蠅中心輕松查詢和訂購所需sgRNA 轉(zhuǎn)基因果蠅品系，實現(xiàn)目的基因的敲除或激活。這些果蠅品系資源將與轉(zhuǎn)基因干擾品系結(jié)合使用，為果蠅研究提供重要的技術(shù)資源，使各個領(lǐng)域的研究達到事半功倍的效果。
17312606166