編者：資源增量是實驗動物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實驗動物對生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保障。自上世紀(jì)80 年代以來，我國老一輩實驗動物科學(xué)家苦心孤詣，在實驗動物資源研發(fā)工作中取得的多項開創(chuàng)新成果。
1988 年《實驗動物管理條例》發(fā)布實施，在實驗動物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質(zhì)量，推動我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實驗動物資源標(biāo)準(zhǔn)化、新品種/品系開發(fā)和動物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國實驗動物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應(yīng)用成果。
實驗用樹鼩種群的建立與標(biāo)準(zhǔn)化
王文廣 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所
樹鼩（Tupaia Belangeris， Tree Shrew）是一種形似松鼠、吻部較長的小型哺乳動物，目前在分類學(xué)上屬于攀鼩目，介于于靈長目與食蟲目之間。樹鼩主要分布于南亞、東南亞及我國南部如云南?貴州?廣西?廣東?海南等省區(qū)，應(yīng)用最為廣泛的是中緬樹鼩滇西亞種。樹鼩的生理生化及免疫學(xué)等生物學(xué)特性近似于人類，與靈長類動物的進(jìn)化關(guān)系比嚙齒類動物更接近，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力，世界衛(wèi)生組織在20世紀(jì)90 年代就建議用樹鼩代替大型靈長類動物進(jìn)行科學(xué)實驗。
早期研究中使用的樹鼩大多來自野外，它們的遺傳背景不清，健康狀況未知，且個體差異較大，不利于科學(xué)研究的順利進(jìn)行，因此就需要建立規(guī)模化的人工樹鼩種群，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的飼養(yǎng)管理和質(zhì)量控制，逐步實現(xiàn)樹鼩資源的實驗動物化。我國從20 世紀(jì)70～80 年代就開始了樹鼩人工馴養(yǎng)繁殖研究，研究力量主要集中在昆明，如中國科學(xué)院昆明動物研究所、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所和昆明醫(yī)科大學(xué)等科研院校。在國家政策引導(dǎo)和各級項目大力支持下，科研人員就樹鼩種質(zhì)資源基地的建立和標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，并取得了突破性成果。
一、 樹鼩的主要生物學(xué)特性
1.樹鼩的體型特征
成年樹鼩體長一般在140cm～190cm，體重在120g～180g。尾部毛發(fā)達(dá)，并向兩側(cè)分散，接近于體長。前后足均具有五趾，每趾都有發(fā)達(dá)而尖銳的爪，吻部尖長，耳較短，頭骨的眶后突發(fā)達(dá)，形成一骨質(zhì)眼球，腦室較大。體毛粟黃色，頜下及腹部為線滅色毛。頸側(cè)有條紋，是區(qū)別樹鼩屬種的重要標(biāo)志。
2.樹鼩的解剖學(xué)特點(diǎn)
樹鼩解剖學(xué)上特點(diǎn)是恥骨與坐骨左右形成1 公分軟骨接合部，鼓骨包已形成；犬齒細(xì)小，前臼齒寬大，齒式為2133/2133=36；脛骨與腓骨獨(dú)立；眼窩與顳窩隔開。
3.樹鼩的生態(tài)學(xué)特性
樹鼩生態(tài)上重要特點(diǎn)之一是膽小，易受驚。如長時間受驚，處于緊張狀態(tài)時，體重下降，睪丸縮小，臭腺發(fā)育受阻，當(dāng)臭腺缺乏時，母樹鼩產(chǎn)后易吃仔甚至生育力喪失。
4.樹鼩的野外習(xí)性
野生樹鼩多在丘陵、平原近農(nóng)舍旁的灌木丘林里活動，在土堆挖洞作穴，亦有在樹上筑巢，雌雄成對生活，不群居。常見單個出沒于叢林或村落，行動靈活，善于攀緣。樹鼩是雜食性動物，常以昆蟲、小鳥、五谷野果為食，更喜甜食如蜂蜜。
5.樹鼩的籠養(yǎng)特性
實驗室飼養(yǎng)的樹鼩喜在籠內(nèi)作翻滾竄跳活動，飼養(yǎng)籠不宜過小，以黎明和黃昏時最為活躍，中午活動較少，晚上卷縮在籠的一角，以尾裹頸而睡。樹鼩喜動能量消耗較大，籠養(yǎng)時須注意有足夠的蛋白質(zhì)飼料，營養(yǎng)缺乏則會體重減輕，毛無光澤，易患疾病而死亡，因此籠養(yǎng)時以標(biāo)準(zhǔn)化的飼料配合水果較好。兩雄相處?；ハ嘁Ф?，因此不宜將兩只雄性同籠飼養(yǎng)。室內(nèi)飼育時，除了保持15℃～28℃室溫和40%～70%的相對濕度等條件外，宜將雌雄樹鼩1:1 配對分籠飼育。樹鼩產(chǎn)育時不能驚動，否則易造成食仔或拒哺乳的情況。
6.樹鼩的繁育特性
樹鼩性成熟時間約為6 個月，懷孕期42 天左右，繁殖能力強(qiáng)，胎仔數(shù)為2～4 只，每年3～8 月為生殖季節(jié)。母樹鼩懷孕時，應(yīng)及時分籠，將孕樹鼩轉(zhuǎn)到繁殖籠內(nèi)單獨(dú)照料，分娩育仔。子樹鼩初生時體重約10 克（9.8±1.4 克），頭身長6.4±0.4 厘米，尾長3.8±0.29 厘米，剛生下的樹鼩全身無毛，皮膚粉紅，眼閉，只會蠕動，5～6 天皮膚變黑，開始長毛，14～21 天開眼，3 周開始走動，4 周可跳動，5～6 周斷奶而獨(dú)立生活。
二、實驗用樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化研究
1.承擔(dān)的研究項目
2006 年云南省科技基礎(chǔ)條件平臺計劃項目“樹鼩馴養(yǎng)繁殖實驗動物標(biāo)準(zhǔn)及丙型肝炎動物模型技術(shù)平臺建設(shè)”。
2009 年國家科技支撐計劃項目“野生動物人工種群的生物凈化及相關(guān)疾病動物模型的建立與評價——普通級樹鼩種群和HCV 感染模型的建立與評價”。
2011 年國家科技支撐計劃項目 “重大疾病動物模型及實驗動物資源的標(biāo)準(zhǔn)化及評價體系的建立”項目子課題“清潔級樹鼩種群和資源保存基地的建立”。
2013 年云南省科技基礎(chǔ)條件平臺計劃項目“云南省醫(yī)學(xué)實驗樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化繁育平臺”。
2014 年國家科技支撐計劃項目“實驗用樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化研究和人類重大疾病樹鼩模型創(chuàng)建與應(yīng)用集成示范”。
2015 年云南省聯(lián)合支持國家科技支撐計劃項目“實驗用樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化研究和人類重大疾病樹鼩模型創(chuàng)建與應(yīng)用集成示范”。
2.建立的質(zhì)量技術(shù)規(guī)范
在前期項目的支持下，完成了樹鼩生物學(xué)特性和免疫學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)測定，建立了樹鼩生理生化臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)庫；制訂了樹鼩生物學(xué)特性共性描述技術(shù)規(guī)范、樹鼩生物學(xué)特性數(shù)據(jù)采集技術(shù)規(guī)范和樹鼩生物學(xué)特性測定技術(shù)規(guī)范，共享于國家自然科技資源平臺網(wǎng)站。
樹鼩微生物、寄生蟲的檢測是質(zhì)量控制的重要內(nèi)容，在大量實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，建立了多種病原體檢測技術(shù)規(guī)范，如實驗樹鼩沙門氏菌、志賀菌檢、變形桿菌屬、皮膚病原真菌、寄生蟲、弓形蟲感染檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，實驗樹鼩腺病毒、單純皰疹病毒、呼腸孤病毒、甲型肝炎病毒、輪狀病毒、柯薩奇病毒PCR 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程等。
3.建立的樹鼩標(biāo)準(zhǔn)
樹鼩標(biāo)準(zhǔn)的制定是樹鼩實驗動物化的重要保證和標(biāo)志，早在2010 年11 月云南省就發(fā)布了地方標(biāo)準(zhǔn)《實驗樹鼩(DB53/T328.1-328.5—2010)》，并于2011 年3 月1 日正式實施， 主要由昆明醫(yī)科大學(xué)制定，其內(nèi)容共分為5 個部分：1.實驗樹鼩（第1 部分）：微生物學(xué)等級及檢測(DB53/T 328.1)； 2.實驗樹鼩（第2 部分）：
寄生蟲學(xué)等級及檢測(DB53/T 328.2)； 3.實驗樹鼩（第3 部分）：遺傳學(xué)質(zhì)量控制(DB53/T 328.3)；4.實驗樹鼩（第4 部分）：配合飼料(DB53/T 328.4)；5.實驗樹鼩（第5 部分）：環(huán)境及設(shè)施(DB53/T 328.5)。2012年5 月又發(fā)布了由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所和昆明理工大學(xué)制定的《實驗樹鼩》云南省地方標(biāo)準(zhǔn)第6～10 部分，即飼養(yǎng)管理、生物學(xué)特性數(shù)據(jù)測定、實驗基本操作技術(shù)、HCV 病毒感染樹鼩原代肝細(xì)胞模型制作和 HCV病毒感染樹鼩模型制作。樹鼩云南省地方標(biāo)準(zhǔn)的頒布填補(bǔ)了我國實驗樹鼩無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的空白，為樹鼩人工繁殖和實驗研究提供了有力的技術(shù)支持。
近年來，隨著大量實驗數(shù)據(jù)的積累，人們也不斷地對樹鼩的地方標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂和完善，并努力向著應(yīng)用范圍更廣的樹鼩國家標(biāo)準(zhǔn)靠近，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制定的6 項樹鼩團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)于2017 年5 月獲得全國實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化委員會頒布，分別是（1）T/CALAS 08-2017 實驗動物 樹鼩微生物學(xué)等級及監(jiān)測；（2）T/CALAS 09-2017 實驗動物 樹鼩寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測；（3）T/CALAS 10-2017 實驗動物 樹鼩環(huán)境與設(shè)施；（4）T/CALAS 11-2017 實驗動物 樹鼩遺傳質(zhì)量控制；（5）T/CALAS 12-2017 實驗動物 樹鼩配合飼料；（6）T/CALAS 13-2017 實驗動物 樹鼩病理學(xué)診斷規(guī)范。該團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的頒布實施，為樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化提供更科學(xué)的技術(shù)支持，并有力推動了樹鼩在全國范圍的推廣和應(yīng)用。
4.成果
2012 年“樹鼩飼養(yǎng)繁殖種群建立及其在HCV 動物模型中的應(yīng)用”，獲得2012 年度云南省科技進(jìn)步一等獎；
2014 年“樹鼩實驗動物化種群建立及應(yīng)用”項目，榮獲2014 年度中國實驗動物學(xué)會科學(xué)技術(shù)獎一等獎；
2014 年“云南橫斷山區(qū)小型哺乳動物冷適應(yīng)模式及生態(tài)適應(yīng)特征的研究”，榮獲2014 年度云南省自然科學(xué)獎三等獎；
2016 年“基于多種再生醫(yī)學(xué)細(xì)胞和動物模型創(chuàng)建的細(xì)胞治療技術(shù)研究”項目，榮獲2016 年度中國實驗動物學(xué)會科學(xué)技術(shù)獎一等獎。
三、實驗用樹鼩的應(yīng)用研究
1.感染性疾病模型的研究
先后有人甲肝、乙肝、丙肝和丁肝病毒感染樹鼩，均在樹鼩體內(nèi)發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制，并觀察到一定的臨床癥狀，其中以乙肝病毒和丙肝病毒模型研究成果較為突出。 Glebe 等發(fā)現(xiàn)HBV 可有效感染成年樹鼩原代肝細(xì)胞，證明pre-S1 結(jié)構(gòu)域是樹鼩肝細(xì)胞感染HBV 必需的抗原，而這一點(diǎn)與HBV 感染人肝細(xì)胞的方式相似[1]。Yan 等以建立樹鼩肝細(xì)胞原代培養(yǎng)感染人類HBV 模型為基礎(chǔ)，成功證明了靈長類動物的鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白為HBV 感染肝細(xì)胞的特異性受體[2]。謝春志[3]、馮悅[4]通過含HCV 的人血清感染樹鼩，均發(fā)現(xiàn)樹鼩可感染人HCV?Barth 等[5]研究發(fā)現(xiàn)樹鼩肝細(xì)胞上I 型清道夫受體、CD81 分子在HCV 包膜粘合到樹鼩肝細(xì)胞中起了重要作用?隨后，Tong Y 等[6]報道了樹鼩CD81 分子、SR-BI 分子和Claudin-1 分子可介導(dǎo)HCV 感染?此外，人們還發(fā)現(xiàn)H1N1 流感病毒[7]、腸道病毒EV71[8]和CA16[9]、登革病毒[10]、HSV 病毒[11]、EB 病毒[12]可感染樹鼩，可用來建立感染模型開展研究。
2.神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型
何保麗等[13]用β-淀粉樣蛋白(Aβ)側(cè)腦室注射建立樹鼩老年癡呆模型，從模型制作后第8 天開始，治療組樹鼩連續(xù)30 天灌胃給予天麻素，通過RT-PCR 檢測海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)mRNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示天麻素能在一定程度上上調(diào)樹鼩海馬BDNF 的表達(dá)?
Ma 等[14]對樹鼩連續(xù)腹腔注射MPTP[3mg/(kg·d)]，5d 后出現(xiàn)典型的帕金森運(yùn)動癥狀，且紋狀體DA 和DOPA水平顯著降低，腦中α-synuclein mRNA 水平升高，提示樹鼩可能是研究PD 發(fā)病機(jī)制的潛在動物模型?鄧苙等[15]的研究指出樹鼩MPTP 模型與6-OHDA 模型相比，PD 行為學(xué)特征更明顯，樹鼩的TH 陽性神經(jīng)細(xì)胞呈雙側(cè)性減少，提示MPTP 經(jīng)腹腔注射是制備樹鼩PD 模型的理想方法?
有學(xué)者注射不同劑量嗎啡到樹鼩體內(nèi)以研究其耐受性和依賴性，注射嗎啡后同時使用納洛酮(1.25mg/kg體重)，發(fā)現(xiàn)樹鼩出現(xiàn)誘導(dǎo)條件性位置厭惡和戒斷癥狀[16]?Shen 等[17]使用樹鼩開展嗎啡成癮性研究，結(jié)果顯示肌肉注射嗎啡(5 或10 mg/kg)30~60 min 后樹鼩的運(yùn)動活性顯著增加；條件性位置偏愛/厭惡實驗結(jié)果顯示，樹鼩偏愛有嗎啡的盒子，而納洛酮誘導(dǎo)條件性位置厭惡；以上研究表明樹鼩可以成為成癮行為和神經(jīng)機(jī)制研究的候選者?
沈芳等[18]利用樹鼩先后建立了社交挫敗模型、習(xí)得性無助模型及慢性溫和應(yīng)激模型，通過藥物抗抑郁實驗發(fā)現(xiàn)，氯丙咪嗪能夠逆轉(zhuǎn)抑郁動物的社交退縮行為，氟西汀對習(xí)得性無助行為具有翻轉(zhuǎn)作用，而卡貝縮宮素則對興趣下降、社交退縮及習(xí)得性無助行為均具有顯著的治療效果[19]。
3.眼科疾病模型研究
樹鼩眼球解剖及視覺系統(tǒng)與人類有高度相似性，感光細(xì)胞以視錐細(xì)胞為主，對形覺剝奪環(huán)境極為敏感，是研究形覺剝奪性近視的極佳動物模型。Siegwart 等[20]將自然睜眼后7、15、21、33、48、63d 樹鼩分別用半透明遮光板單眼剝奪12d 觀察眼軸的延長，發(fā)現(xiàn)樹鼩近視的易感期的高峰時段大約發(fā)生在睜眼后15～45d 之間?周廣龍等[21]通過單眼形覺剝奪建立樹鼩弱視模型，發(fā)現(xiàn)形覺剝奪引起的神經(jīng)元損傷具有可恢復(fù)性，C□fos 基因和蛋白可能參與了形覺剝奪視皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷及可塑性，結(jié)果顯示樹鼩有潛力成為良好的形覺剝奪弱視模型?
李妍等[22]采用基質(zhì)注射茄病鐮刀菌孢子的方法首次成功建立茄病鐮刀菌性角膜炎樹鼩模型，并發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-1β 和IL-6 及抑炎因子IL-10 在樹鼬茄病鐮刀菌性角膜炎炎癥反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Samuels BC等[23]向成年樹鼩眼睛前房中注射25mg/mL 的磁珠溶液，從而誘發(fā)青光眼，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(RNFL)顯著減少，視神經(jīng)表現(xiàn)出與青光眼性視神經(jīng)病變相一致的組織病理學(xué)變化。
4.代謝疾病模型研究
Li HY 等[24]采用高糖脂肪飲食與地塞米松聯(lián)合誘發(fā)了樹鼩2 型糖尿病。Wu XY 等[25]使用不同劑量的STZ (60、70 和80 毫克/千克)也建立了類似的2 型糖尿病樹鼩模型。此外，有人通過高糖高脂肪飲食和四次STZ 注射成功建立了糖尿病腎病樹鼩模型，并通過實驗證明骨髓移植也可以提高胰島素抵抗性[26]。
Xing Huijie 等配制不同濃度的食用酒精溶液供樹鼩飲用，2 周后引發(fā)生酒精代謝酶改變和脂肪肝樣病理改變[27]，而Meng 等人發(fā)現(xiàn)羅格列酮可以預(yù)防樹鼩的脂肪肝發(fā)育[28]。Zhang LQ 等[29]使用高脂肪、膽固醇和膽酸鹽飲食，成功地在樹鼩中誘發(fā)了非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，發(fā)現(xiàn)Poloxamer 407 對脂蛋白脂肪酶的抑制改善了脂肪病的嚴(yán)重程度，減輕了炎癥，與小鼠脂肪肝病模型相比，樹鼩模型發(fā)病時間較短但癥狀更為明顯。
5.干細(xì)胞治療
在國家科技支撐計劃項目（2014BAI01B00）支持下，解放軍昆明總醫(yī)院已建立樹鼩臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定技術(shù)體系及規(guī)范，制備儲存樹鼩臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2000 份；建立了樹鼩臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)GFP 基因標(biāo)記、BrdU 標(biāo)記、DAPI 標(biāo)記和順磁標(biāo)記，為研究間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為提供了分析測試方法；以樹鼩代謝綜合征[30]、糖尿病[31]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型[32]為研究對象，進(jìn)行了樹鼩臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的療效評價，為干細(xì)胞臨床療法提供了技術(shù)參考。
四、實驗用樹鼩種群建立的意義
樹鼩是我國特色動物資源，開展樹鼩的實驗動物化和種質(zhì)資源保存是一項國家戰(zhàn)略性任務(wù)， 而建立標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；臉潼毞N質(zhì)資源基地，是實現(xiàn)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、生產(chǎn)規(guī)?；?、供應(yīng)商品化和服務(wù)社會化的根本前提，具有重要應(yīng)用價值和戰(zhàn)略意義。
建立標(biāo)準(zhǔn)化樹鼩種群，可有力促進(jìn)其在生命科學(xué)領(lǐng)域的推廣應(yīng)用，可為探討人類疾病致病機(jī)制和開發(fā)新型治療藥物等提供良好的實驗動物模型，滿足生命科學(xué)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求，促成相關(guān)科學(xué)研究的重大突破。
樹鼩種質(zhì)資源基地的建立及標(biāo)準(zhǔn)化研究技術(shù)體系和成果，可為我國其他實驗動物新品種的研發(fā)、保存和共享提供借鑒，共同促進(jìn)我國實驗動物種質(zhì)資源保存工作的專業(yè)化和系統(tǒng)化。
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