經(jīng)過5年科研攻關(guān)，中國科學(xué)家培育出世界上首只高比例胚胎干細(xì)胞“嵌合猴”。
這只“嵌合猴”由食蟹猴（長尾獼猴）的兩個(gè)基因不同的胚胎的細(xì)胞培育而來。11月10日，這項(xiàng)由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）研究員劉真、孫強(qiáng)和中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院研究員Miguel A. Esteban研究組合作完成的研究，以封面論文形式在線發(fā)表于《細(xì)胞》。
“這是該領(lǐng)域長期追求的一個(gè)目標(biāo)。它毫無疑問是迄今除了嚙齒類動(dòng)物之外，利用多能干細(xì)胞產(chǎn)生嵌合體動(dòng)物的最佳實(shí)證?！痹撜撐亩辔粚徃迦巳缡窃u(píng)價(jià)。
中國科學(xué)院院士季維智評(píng)價(jià)該研究是靈長類多能干細(xì)胞多能性研究的一個(gè)重要突破，為干細(xì)胞多能性研究提供了一個(gè)重要平臺(tái)，也為后續(xù)利用干細(xì)胞建立疾病猴模型，通過四倍體補(bǔ)償法產(chǎn)生干細(xì)胞猴以及體內(nèi)構(gòu)建組織器官打下了重要的基礎(chǔ)。
闖過“兩道關(guān)”
胚胎干細(xì)胞是生命發(fā)育早期的“種子”細(xì)胞，具有無限自我復(fù)制更新的能力和極強(qiáng)的誘導(dǎo)分化發(fā)育潛能。這使得它們?cè)诩?xì)胞治療、器官再生、類器官模型構(gòu)建等方面發(fā)揮著重要作用。
如何證明胚胎干細(xì)胞具有多向分化潛能呢？一個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”是將取自一個(gè)囊胚的干細(xì)胞注射到發(fā)育中的另一個(gè)囊胚內(nèi)，形成擁有不同基因型的嵌合體。
“理論上，注射的胚胎干細(xì)胞具有很強(qiáng)的體內(nèi)發(fā)育潛能，可以為嵌合體不同器官的發(fā)育作出很大的貢獻(xiàn)?！闭撐耐ㄓ嵶髡邉⒄嬖诮邮堋吨袊茖W(xué)報(bào)》采訪時(shí)說。
胚胎干細(xì)胞的發(fā)育多能性已在嚙齒類動(dòng)物中得到了證明?？茖W(xué)家在1984年首次實(shí)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞胚胎注射形成嵌合體，于2008年成功實(shí)現(xiàn)大鼠胚胎干細(xì)胞胚胎注射形成嵌合體。構(gòu)建非人靈長類胚胎干細(xì)胞嵌合體技術(shù)對(duì)生物醫(yī)藥研究具有重要意義，然而相關(guān)研究一直進(jìn)展緩慢。
制造嵌合體，要先把干細(xì)胞從囊胚內(nèi)取出放在體外培養(yǎng)，再把體外擴(kuò)增培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞重新放回囊胚生長發(fā)育。“一出一進(jìn)”之間有兩大難關(guān)。
第一大難關(guān)是如何獲得具有高效發(fā)育潛能的胚胎干細(xì)胞。為突破難關(guān)，劉真與合作者選擇發(fā)育到第7天的食蟹猴囊胚分離干細(xì)胞，這個(gè)時(shí)期的囊胚已經(jīng)分裂出約100個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞都具有非常強(qiáng)的分化發(fā)育潛能，但尚未開始出現(xiàn)方向性的分化。研究人員將分離的干細(xì)胞放在體外培養(yǎng)，讓其保留分裂復(fù)制特征，但不再向下分化。
他們最后建立了食蟹猴的9個(gè)干細(xì)胞系，并將其放置在6種不同的培養(yǎng)體系下對(duì)其“健康”進(jìn)行把關(guān)。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、線粒體代謝、全基因組測(cè)序等多方面系統(tǒng)評(píng)估，研究人員確定了具有更高多能性、更好傳代穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性的多個(gè)干細(xì)胞系。
第二大難關(guān)是胚胎干細(xì)胞注射到受體胚胎后的快速凋亡。為此，研究團(tuán)隊(duì)給選出的胚胎干細(xì)胞標(biāo)記綠色熒光蛋白，以追蹤干細(xì)胞存活情況。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)、試錯(cuò)，他們終于找到了既不影響胚胎正常發(fā)育，又能保證干細(xì)胞存活的最優(yōu)嵌合胚胎培養(yǎng)條件。
2021年初，闖過上述難關(guān)的劉真與合作者把選好的干細(xì)胞注射到早期的猴子桑葚期胚胎（發(fā)育4~5天的胚胎）中，并將74個(gè)具有明顯嵌合的囊胚移植到40只受體雌猴體內(nèi)，最后獲得了4只流產(chǎn)的胚胎和6只出生的猴子。
這些流產(chǎn)的胚胎或活產(chǎn)的猴子是否都是嵌合體呢？研究人員檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，只有1只流產(chǎn)的胚胎和1只活產(chǎn)的猴子產(chǎn)生了明顯的嵌合。
“所以，做出嵌合體的成功率約40%，做出活產(chǎn)嵌合體的成功率約20%?！闭撐墓餐ㄓ嵶髡邔O強(qiáng)對(duì)《中國科學(xué)報(bào)》說。
“雖然效率有限，但結(jié)果不算太糟?！眲⒄嬲f。
這個(gè)“不算太糟”的結(jié)果就是世界上首只高比例胚胎干細(xì)胞嵌合猴，研究人員花費(fèi)了近3年時(shí)間才讓它成功降世。
不可能成功的成功
由于非人靈長類嵌合體培養(yǎng)存在巨大挑戰(zhàn)，2012年，美國科學(xué)家在發(fā)表于《細(xì)胞》的一項(xiàng)研究中曾認(rèn)為，猴胚胎干細(xì)胞不能產(chǎn)生嵌合體，挑戰(zhàn)了靈長類胚胎干細(xì)胞多能性理論基礎(chǔ)。
不過，科學(xué)家并未放棄嘗試。昆明理工大學(xué)的科學(xué)家隨后證明猴多能干細(xì)胞，包括始發(fā)態(tài)的多能干細(xì)胞，能夠產(chǎn)生嵌合體，但嵌合率僅為0.1%~4.5%?！斑@表明當(dāng)時(shí)所獲得的多能干細(xì)胞與囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或外胚層，仍存在較大差異?！崩ッ骼砉ご髮W(xué)省部共建非人靈長類生物醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授李天晴說。
此次，研究人員使用綠色熒光蛋白標(biāo)簽、基因測(cè)序以及其他測(cè)試方法，確認(rèn)了活產(chǎn)猴大腦、心臟、腎臟、肝臟和胃腸道中都含有干細(xì)胞來源細(xì)胞的組織類型。在不同組織類型中的貢獻(xiàn)從21%到92%不等，在測(cè)試的26種不同組織類型中平均為67%。相比之下，那只流產(chǎn)嵌合體猴的平均貢獻(xiàn)比例約為20%。
“這些數(shù)據(jù)有力地證明了猴子多能干細(xì)胞具有在體內(nèi)分化成各種組織的能力?！闭撐墓餐ㄓ嵶髡進(jìn)iguel A. Esteban對(duì)《中國科學(xué)報(bào)》說，“這項(xiàng)研究加深了對(duì)靈長類動(dòng)物多能干細(xì)胞發(fā)育潛力的理解?！?/p>
研究人員將取自雌性猴子胚囊的干細(xì)胞放入雄性胚胎后，發(fā)現(xiàn)盡管最終形成的存活嵌合體是雄性，但其血液細(xì)胞、皮膚細(xì)胞中檢測(cè)出部分雌性基因。
“這很有趣?！睂O強(qiáng)說，“它證明了干細(xì)胞的分化潛力，也再次證明了胚胎干細(xì)胞確實(shí)貢獻(xiàn)到了嵌合體猴。”
此外，研究團(tuán)隊(duì)在兩只嵌合體的胎盤組織中都發(fā)現(xiàn)了高比例的胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)。考慮到此前小鼠胚胎干細(xì)胞幾乎不會(huì)貢獻(xiàn)到胎盤組織，說明靈長類胚胎干細(xì)胞可能具有獨(dú)特的發(fā)育全能性。他們?cè)趦芍磺逗象w猴的生殖細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞的高比例貢獻(xiàn)，這為構(gòu)建遺傳修飾模型猴奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
“利用靈長類多能干細(xì)胞生產(chǎn)嵌合體是這一領(lǐng)域長期追求的目標(biāo)。原則上，這項(xiàng)研究將為相關(guān)基礎(chǔ)研究和非人類靈長類遺傳修飾模型的產(chǎn)生開辟新途徑。具體來說，利用胚胎干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)基因修飾能力，將使完成目前在受精卵或胚胎階段使用CRISPR技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)的研究成為可能?！币晃粚徃迦巳缡窃u(píng)價(jià)。
在“無人區(qū)”冒險(xiǎn)
作為一名中國本土科學(xué)家，劉真從研究生到博士后一直在神經(jīng)科學(xué)研究所工作。他是一名敢于在“無人區(qū)”冒險(xiǎn)的科學(xué)家。
克隆猴是一直以來沒被解決的問題，甚至曾被斷言不可能解決。2018年，仍在從事博士后研究的劉真作為第一作者和導(dǎo)師孫強(qiáng)以封面文章形式在《細(xì)胞》發(fā)表體細(xì)胞克隆猴“中中”“華華”。這一科研成果讓全球科學(xué)界矚目。
此外，劉真作為第一作者建立的自閉癥非人靈長類模型、世界首例生物節(jié)律紊亂體細(xì)胞克隆猴模型先后發(fā)表于《自然》《國家科學(xué)評(píng)論》等期刊。今年4月，他作為通訊作者和團(tuán)隊(duì)在《細(xì)胞-干細(xì)胞》發(fā)表的體外重構(gòu)非人靈長類類囊胚研究，首次將非人靈長類的類囊胚體外培養(yǎng)至著床后原腸胚時(shí)期。英國牛津大學(xué)干細(xì)胞生物學(xué)家Alejandro De Los Angeles評(píng)論稱：“這些發(fā)現(xiàn)是干細(xì)胞類胚胎模型領(lǐng)域的一個(gè)里程碑?！?/p>
“做科研一定要敢于冒險(xiǎn)?！眲⒄嬲f，“就像研究生入學(xué)時(shí)，蒲慕明院士講的那樣，要敢于啃‘硬骨頭’?！?/p>
“我們的目標(biāo)不只是一步領(lǐng)先，而是要步步領(lǐng)先?！眲⒄嬲f。
生命科學(xué)前沿的路并不好走。除了科研方面的難題，每一次，劉真與合作者們介紹研究成果時(shí)，必然會(huì)被“拷問”相關(guān)倫理問題。比如嵌合體研究是否會(huì)帶來像希臘神話中“奇美拉”一樣的怪物。
對(duì)此，劉真表示，相關(guān)研究都遵循了國際國內(nèi)相關(guān)程序，確保遠(yuǎn)離紅線。
“目前，我們開展的只是基礎(chǔ)科學(xué)研究。相關(guān)研究未來對(duì)基因工程技術(shù)發(fā)展和瀕危物種保護(hù)有實(shí)際意義，可以幫助我們構(gòu)建更精確的猴模型，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究?！彼f，比如建立“漸凍癥”動(dòng)物模型，推動(dòng)相關(guān)疾病治療。
下一步，研究人員希望提升嵌合體猴的培育效率，并進(jìn)一步探索制約嵌合體猴生存的因素。
據(jù)介紹，首只胚胎干細(xì)胞系“嵌合猴”僅存活了10天，其背后的原因目前研究團(tuán)隊(duì)尚不清楚。他們僅發(fā)現(xiàn)嵌合體中由胚胎干細(xì)胞發(fā)育而來的細(xì)胞和由受體胚胎細(xì)胞發(fā)育而來的細(xì)胞在表觀遺傳修飾上存在一些差別。
“所以，我們要繼續(xù)尋找原因?！眲⒄嬲f。
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