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美鳳力臨床前大動物實(shí)驗(yàn)中心
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1987年Brian Sauer博士報(bào)道了Cre-loxP重組系統(tǒng)可用在細(xì)胞中操作特定位點(diǎn)的特異性重組，由于該系統(tǒng)具有操作簡單、重組率高的優(yōu)點(diǎn)，如今已成為體內(nèi)外遺傳操作的常用工具?，F(xiàn)在利用Cre-lox系統(tǒng)，我們可以在特定細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體，甚至在特定時(shí)間點(diǎn)敲除或表達(dá)某個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)對特定基因的時(shí)空特異性操作，這對基因功能的研究和人類疾病動物模型的建立都有重大意義。 1.什么是Cre-lox系統(tǒng)？ 從名字就能知道這套系統(tǒng)的兩個(gè)主要組成部分： Cre重組酶 環(huán)化重組酶（Cre, cyclization recombinase），是酪氨酸位點(diǎn)特異性重組酶之一，能催化兩個(gè)DNA識別位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組。Cre重組酶來源于P1噬菌體，由 343個(gè)氨基酸組成，能特異性地識別Lox位點(diǎn)。除Cre以外，此類重組酶還有Flp（flipase）和Dre（D6特異性重組酶）。 Lox位點(diǎn) Cre重組酶識別的回文DNA位點(diǎn)，也叫l(wèi)oxP (locus of X-over P1) 位點(diǎn)，長34bp，其特征結(jié)構(gòu)為 ATAACTTCGTATA -NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。兩邊反向互補(bǔ)的13個(gè)堿基為Cre重組酶的識別序列，中間的8個(gè)堿基為重組發(fā)生位置，這也決定了loxP的方向。N表示可變堿基，不同的堿基選擇可形成不同的 Lox位點(diǎn)，除了野生型loxP，常見的還有 Lox2272，Lox511，Lox5171等。 圖1 . loxP位點(diǎn)及其突變體位點(diǎn)（圖片來自Ref.1） 在同一個(gè) DNA 分子上，根據(jù)Lox位點(diǎn)的位置與方向，可能會發(fā)生3種不同的重組事件： （1）切除：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)在同一染色體上且方向相同時(shí)，將切除同向Lox位點(diǎn)之間的DNA序列。 （2）反轉(zhuǎn)：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)位于同一染色體上且方向相反時(shí)，兩個(gè)Lox位點(diǎn)之間的序列發(fā)生序列反轉(zhuǎn)，即顛倒。 （3）易位：如果兩個(gè)Lox位點(diǎn)位于不同的染色體上且方向相同，將導(dǎo)致2條染色體上DNA片段的交換。 圖2. Cre的重組機(jī)制。A）loxP位點(diǎn)的基本結(jié)構(gòu)。紅色箭頭指示loxP位點(diǎn)的方向。B）Cre-loxP介導(dǎo)的易位重組。C）左圖示Cre介導(dǎo)兩同向loxP位點(diǎn)間的切除重組。右圖示Cre介導(dǎo)兩反向loxP位點(diǎn)間的反轉(zhuǎn)重組。（圖片來自Ref.2） 2.體內(nèi)Cre-lox系統(tǒng)的基礎(chǔ)應(yīng)用 Cre-lox系統(tǒng)通常包括兩種小鼠：一是Cre工具鼠，該小鼠中的Cre重組酶由特定啟動子驅(qū)動，可在特定細(xì)胞或組織表達(dá)Cre重組酶；二是Flox小鼠，即在小鼠靶基因序列兩側(cè)帶有Lox位點(diǎn)。將上述兩種小鼠雜交繁育，子代中可以獲得既帶有Cre又帶有Flox基因的小鼠，即基因條件性敲除或過表達(dá)小鼠。 基因條件性表達(dá)所需要的Flox小鼠，一般在靶基因與啟動子之間有一個(gè)“終止盒”（lox-stop-lox）。這些Flox小鼠與細(xì)胞類型特異性表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠交配后獲得的子代小鼠中，在每個(gè)表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞中，終止盒被Cre切除，因此僅在這些細(xì)胞中表達(dá)所需的轉(zhuǎn)基因。 圖3. 條件性基因表達(dá)小鼠原理示意圖（圖片來自Ref.3） 基因條件性敲除的Flox小鼠，一般在需要切除的DNA片段兩側(cè)帶有同方向的兩個(gè)Lox位點(diǎn)（lox-GENE-lox）。與細(xì)胞類型特異性Cre小鼠交配后，Cre 重組酶會識別Lox位點(diǎn)，導(dǎo)致靶基因被敲除。 圖4. 條件性基因敲除小鼠原理示意圖（圖片來自Ref.3） 3. 更精準(zhǔn)的誘導(dǎo)型Cre-lox系統(tǒng) 為了能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行遺傳功能研究，時(shí)間特異性的Cre-lox（也叫誘導(dǎo)型Cre-lox）被開發(fā)出來，可用于研究生物體發(fā)育過程特定階段的基因功能，或用來進(jìn)行譜系示蹤等。常用誘導(dǎo)型Cre-lox系統(tǒng)有： 也叫他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)，將Cre與雌激素受體ER融合，可通過他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)Cre的重組活性。在沒有他莫昔芬的情況下，CreER融合蛋白與熱休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于細(xì)胞質(zhì)中（圖5.1）。給予他莫昔芬藥物處理會破壞HSP90與CreER的相互作用（圖5.2）。ER與Tam的相互作用誘導(dǎo)Cre的核易位（圖5.3）。在細(xì)胞核中，CreER識別loxP位點(diǎn)（圖5.4）并使組織X中的基因Y失活（圖5.5）。CreERT2在體內(nèi)對藥物誘導(dǎo)的敏感性更高，因此一般優(yōu)選使用CreERT2。 圖5. 他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)。（圖5-7來自Ref.4） 四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)，也叫強(qiáng)力霉素（Dox，四環(huán)素衍生物）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)。該系統(tǒng)有兩種模式：Tet-on和Tet-off，分別是Dox依賴性Cre的激活和Dox依賴性Cre的失活。Tet系統(tǒng)包括以下元件：反向四環(huán)素控制反式激活因子（rtTA）；四環(huán)素控制反式激活因子（tTA）；四環(huán)素響應(yīng)元件（TRE），通常是19個(gè)核苷酸的四環(huán)素操縱子（tetO）序列的7個(gè)重復(fù)，調(diào)節(jié)Cre基因的表達(dá)。Dox通常在小鼠的飼料或飲水中進(jìn)行給藥。 Cre;Tet-on系統(tǒng)：在Tet-on系統(tǒng)中，表達(dá)普遍存在的或組織特異性的啟動子驅(qū)動的rtTA。在沒有Dox的情況下，失活的rtTA無法與負(fù)責(zé)調(diào)控Cre基因的TRE序列結(jié)合，則Cre不表達(dá)。在Dox給藥之后，Dox結(jié)合并激活rtTA。激活的rtTA與TRE序列結(jié)合并誘導(dǎo)Cre表達(dá)。 圖6. Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-on系統(tǒng)。Dox給藥才能打開Cre表達(dá) Cre;Tet-off系統(tǒng)：另一方面，在Tet-off系統(tǒng)中，在沒有Dox的情況下，激活的tTA能夠結(jié)合Cre前的TRE序列并誘導(dǎo)Cre表達(dá)。而在Dox給藥后，與Dox相互作用的tTA被滅活。滅活的rTA不再與TRE結(jié)合，因此Cre表達(dá)受到抑制。 圖7. Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-off系統(tǒng)。Dox給藥后關(guān)閉Cre表達(dá) 4.南模生物Cre工具鼠庫 南模生物可提供超過300多種自主產(chǎn)權(quán)Cre工具鼠，覆蓋全身各類型的細(xì)胞組織，滿足科研人員多樣化的需求。同時(shí)，我們還在對Cre工具鼠進(jìn)行全面的驗(yàn)證，目前已經(jīng)完成了100多種Cre工具鼠的驗(yàn)證工作。 為了方便大家更快的找到自己想要的Cre工具鼠，我們還特別定制了Find Cre搜索系統(tǒng)，該系統(tǒng)現(xiàn)已在官網(wǎng)上線，免費(fèi)使用。Find Cre整個(gè)界面以小鼠組織、器官和系統(tǒng)為主線，可分為肺、肝、胃腸道、乳腺、胰腺、感覺器官、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、骨骼肌系統(tǒng)以及其他組織器官。選擇自己感興趣的組織器官，就可以查看該組織下可用的Cre工具鼠。 部分Cre品系驗(yàn)證數(shù)據(jù)如下： 1 Myh6-Cre Myh6特異性靶向小鼠心肌細(xì)胞，驗(yàn)證數(shù)據(jù)證明Myh6-Cre鼠是可以用于心臟特異性基因編輯的工具鼠。 圖8. 熒光檢測tdTomato在Myh6-Cre; Rosa26 tdTomato 小鼠胚胎中的表達(dá)，結(jié)果表明在E13.5和E14.5天小鼠心肌細(xì)胞均有tdTomato表達(dá)。 2 Alb-CreERT2 Alb-CreERT2小鼠是研究肝臟基因功能與疾病的重要小鼠品系，驗(yàn)證數(shù)據(jù)證明Alb-CreERT2小鼠可以成為實(shí)現(xiàn)肝臟時(shí)間特異性敲除或表達(dá)的工具鼠。 圖9. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝組織X-gal染色。未使用他莫昔芬誘導(dǎo)的小鼠，肝細(xì)胞未被染色；使用他莫昔芬誘導(dǎo)的小鼠，肝細(xì)胞成功著色。 圖10. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝組織免疫熒光檢測。Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠被他莫昔芬誘導(dǎo)后，LacZ（紅色）表達(dá)。 圖11. Alb-CreERT2小鼠血生化檢測。結(jié)果顯示Alb-CreERT2小鼠與野生型小鼠相比肝功能正常 3 Pvalb-Cre Pvalb-Cre在中間神經(jīng)元中表達(dá)iCre重組酶，而不干擾內(nèi)源性Pvalb表達(dá)。這些小鼠可能對研究神經(jīng)元分化有用。 圖12. 熒光檢測Pvalb-Cre+/-; Rosa26 tdTomato+/-小鼠大腦皮層中間神經(jīng)元tdTomato的表達(dá)。 圖13. 熒光檢測Pvalb-Cre+/-; Rosa26 tdTomato+/-小鼠海馬中間神經(jīng)元tdTomato的表達(dá)。 結(jié)果顯示：雙陽性小鼠海馬中間神經(jīng)元有tdTomato的表達(dá)，表達(dá)類型符合預(yù)期。 4、Ucp1-CreERT2 Ucp1-CreERT2在棕色脂肪中表達(dá)CreERT2重組酶，驗(yàn)證數(shù)據(jù)證明Ucp1-CreERT2小鼠是可以用于棕色脂肪特異性基因編輯的工具鼠。 圖14. 熒光檢測 Ucp1-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/- 小鼠棕色脂肪和白色脂肪中 tdTomato 的表達(dá)。Ucp1-CreERT2 小鼠與 R26-tdTomato 小鼠進(jìn)行交配，取棕色脂肪組織和白色脂肪組織進(jìn)行熒光顯微鏡拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 Ucp1-CreERT2 小鼠經(jīng) Tamoxifen 誘導(dǎo)后可以在棕色脂肪中表達(dá)。 5 Tyr-CreERT2 Tyr-CreERT2特異性靶向黑色素細(xì)胞，驗(yàn)證數(shù)據(jù)證明Tyr-CreERT2鼠是可以用于黑色素細(xì)胞特異性基因編輯的工具鼠。 圖15. 熒光檢測 Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/- 小鼠尾部表皮基底層的表達(dá)情況。 （A） R26-tdTomato+/-小鼠使用他莫昔芬誘導(dǎo)，表皮基底層的黑素細(xì)胞無紅色熒光信號。 (B) Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-小鼠腹腔注射玉米油，表皮基底層的黑素細(xì)胞無紅色熒光信號。 （C） Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-小鼠腹腔注射他莫昔芬，表皮基底層的黑素細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光信號。 圖16. Tdtomato表達(dá)位置圖；結(jié)論：Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/- 小鼠他莫昔芬誘導(dǎo)后表達(dá)在尾部皮膚基底層（白色虛線所示)的黑色素細(xì)胞（白色箭頭所指）。 References 1. Missirlis PI, Smailus DE, Holt RA. Ahigh-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics ofthe loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics.2006;7:73. Published 2006 Apr 4. doi:10.1186/1471-2164-7-73 2. Tronche F, Casanova E, Turiault M, Sahly I, Kellendonk C. When reversegenetics meets physiology: the use of site-specific recombinases in mice. FEBSLett. 2002;529(1):116‐121. doi:10.1016/s0014-5793(02)03266-0 3. Magnuson M , Osipovich A . Pancreas-Specific Cre Driver Lines and Considerations for Their Prudent Use[J]. Cell Metabolism, 2013, 18(1):9-20. 4. Kim H, Kim M, Im SK, Fang S.Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles oftarget genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147‐159. doi:10.5625/lar.2018.34.4.147 5. Song AJ, Palmiter RD. 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2.1基因條件性表達(dá)
2.2 基因條件性敲除
3.1 CreER系統(tǒng)
3.2 Cre;Tet系統(tǒng)
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