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摘要：在過去十年中，斑馬魚開始作為發(fā)育生物學的典范，也得到了免疫學家和腫瘤學家的關注。斑馬魚具有體積小、繁殖力強、基因組完整等特點，是一個極具吸引力的模型體系。事實上，魚在生命早期是透明的，結合越來越多的魚免疫細胞報告，可以在體內追蹤完整機體的免疫反應。由于斑馬魚從受精卵開始發(fā)育，可以從生命的開始監(jiān)控免疫發(fā)育。斑馬魚是研究腸道炎癥和損傷基本過程的一種有趣的模式生物。本文將首先提供斑馬魚腸道發(fā)育、細菌定植和免疫的一些背景知識，顯示出與哺乳動物的相似性和差異性。

關鍵詞：斑馬魚 小腸結腸炎 免疫 腸道 炎癥

簡介：事實上，魚在生命早期（2周）是透明的，與免疫細胞報告魚的生長表相結合，可以在體內對完整機體的免疫反應進行跟蹤。由于斑馬魚從受精卵發(fā)育，從生命開始就可以監(jiān)控免疫發(fā)育。在斑馬魚中，首先出現(xiàn)先天性免疫系統(tǒng)（巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞），其次是適應性免疫，從受精后的兩到三周開始發(fā)展。斑馬魚通常在受精后2天從絨毛膜孵化，盡管這取決于溫度。在較低溫度下生長魚類會延遲孵化。第3天斑馬魚開口，整個胃腸管在受精后第6天開放。此時，卵黃囊被消耗，幼蟲開始進食小原生動物，如草履蟲。在幾個星期的過程中，腸道發(fā)展，同時幾個細菌物種殖民胃腸道。

斑馬魚胃腸道：硬骨魚類是極其多樣化和豐富的魚類群。當討論魚的胃腸道時，需要提到的一個重要特征是胃的存在。在硬骨魚類中，我們可以找到有和沒有胃的魚。例如，尼羅羅非魚和大西洋鱈魚有胃，而河豚、百里香、鯉魚和斑馬魚缺乏胃。胃腺首先出現(xiàn)在大約4億5000萬年前，似乎是大多數顎口（顎）脊椎動物的特征。由于H+/K+ - ATPase（ATP4A和ATP4B）和編碼胃蛋白酶原的基因丟失，脊椎動物的胃腺喪失（脊椎動物腸的簡化）發(fā)生了數次；斑馬魚不是胃，而是有前腸，稱為腸球，它比后部有更大的內腔，因此可以作為與胃相媲美的儲層。然而，根據Nalband等人的研究，這種腸球缺乏胃腺，因此沒有低pH值。在穩(wěn)態(tài)條件下，斑馬魚腸道的pH值不低于7.5。斑馬魚的腸管形成始于體節(jié)中期至后期（18體節(jié)），而在哺乳動物中，腸道在早期體節(jié)開始形成（1～2體節(jié)）。在18體節(jié)階段，一個連續(xù)的內層薄層變得可區(qū)分，這將產生原始的腸內胚層。盡管斑馬魚腸道形成較晚，腸管形成的時間順序是相同的。與哺乳動物一樣，斑馬魚的喙腸首先形成，其次是后腸和中腸。腸道斑馬魚上皮層缺乏腸隱窩，然而，指狀突起稱為皺襞（絨毛），前部至后部的大小減小。發(fā)現(xiàn)不同分化的上皮細胞如吸收腸細胞（前腸和小腸）、黏液產生杯狀細胞（整個腸）和腸內分泌細胞（前腸）。也沒有發(fā)現(xiàn)經典的微體細胞（M）細胞，雖然第四上皮細胞類型被確定在腸的后段，其中含有大量空泡，其中可以存儲腔內容物。Payle的缺失和卵泡相關上皮的缺乏提示斑馬魚沒有M細胞，然而，上述M型空泡化細胞可能將管腔內容傳遞給存在于上皮層之下的分散免疫細胞。與哺乳動物相反，斑馬魚沒有粘膜下層。哺乳動物的粘膜下層是一層疏松的結締組織，包含血液和淋巴管和神經，位于粘膜下面（絨毛），將粘膜與下方的平滑肌層連接起來。在斑馬魚中，平滑肌層不那么復雜，直接附著在粘膜上。斑馬魚的腸神經細胞體存在于圓形和縱向平滑肌層之間。像哺乳動物一樣，上皮細胞從褶皺的底部遷移到細胞凋亡的褶皺頂端。BrdU染色顯示，這種遷移在前腸5～7天，中腸7～10天。與哺乳動物一樣，上皮翻轉和分化依賴于微生物定植。有趣的是，在斑馬魚中控制上皮細胞向分泌譜系分化的機制似乎是高度保守的，在哺乳動物中類似于Delta Notch信號。在沒有缺口激活的情況下，所有上皮細胞分化為分泌譜系的細胞。同樣，斑馬魚T細胞因子4（TCF4）在維持整個腸道的增殖性自我更新中是重要的。鑒于這種高功能同源性，斑馬魚是研究腸上皮更新機制的一個很好的模型。斑馬魚雖然沒有像哺乳動物那樣的5個腸段（即空腸、十二指腸、回腸、盲腸（闌尾）和結腸），但它們具有功能同源性。在斑馬魚中，三個不同的腸段在形態(tài)學和基因表達的基礎上被區(qū)分：前腸段（腸泡）、中腸和后腸段。消化酶強烈表達于最長的皺褶的前段。這些消化酶和溶質轉運蛋白存在在腸的前部和中部突出了這兩個片段中營養(yǎng)吸收的功能。腸脂肪酸結合蛋白2在前腸和腸中部的表達最高，IFABP6主要表達于后腸。中腸的最后部分含有上述空泡狀（M型）細胞，這可能表明除了營養(yǎng)吸收外，該區(qū)域可能在粘膜免疫中起作用。后部的上皮皺襞較短，這部分不含吸收的腸細胞，但很可能與水吸收有關。對成年斑馬魚的腸道進行微陣列分析，將其分成7個等長的段（從前1段到后7段）。

腸道微生物定植：地球上所有的動物，無論是水生動物還是陸地動物，都與環(huán)境中的微生物共同進化。從微生物生態(tài)學的研究進展來看，微生物不僅寄生在宿主體內，而且對宿主的生理和免疫也有很大的影響。反之亦然，宿主能夠控制哪些物種能夠在腸道內定居，通過對某些進行免疫應答而耐受其他物種。在益生菌動物中進行的研究表明微生物對宿主有巨大的影響。微生物可以影響食品加工，使其他不消化的食物成分可供宿主使用。同樣，微生物可以合成維生素并刺激上皮更新。在這212個基因中，59個反應在小鼠和斑馬魚之間是保守的。這些保守的基因主要參與上皮細胞增殖、促進營養(yǎng)代謝和先天免疫應答。這表明對微生物的反應部分是高度保守的。微生物通過處理不可觸及的食物成分來提高食物的能量吸收。在斑馬魚中，微生物的存在也會導致脂肪組織中脂肪的增加。微生物抑制血管生成素樣蛋白4（ANGPTL4/FIAF）的腸上皮表達。ANGPTL4/FIAF是脂蛋白脂肪酶的循環(huán)抑制劑，通過抑制抑制劑的定植導致脂肪的儲存。飲食誘導的微生物群組成的改變，如小鼠和人類，影響脂肪吸收和宿主能量平衡。微生物也誘導斑馬魚腸道發(fā)育。貝茨和同事發(fā)現(xiàn)，在沒有微生物群的情況下，斑馬魚腸上皮在分化過程中停止。他們觀察到缺乏刷狀腸堿性磷酸酶活性，表面上不成熟的糖蛋白表達模式和杯狀細胞和腸內分泌細胞的缺乏。此外，在沒有微生物的情況下，斑馬魚腸不能在小腸中攝取蛋白質大分子。顯示腸內容物的轉運時間減少（更快的腸蠕動）。用細菌定植這些魚逆轉了效果。有趣的是，無細菌斑馬魚暴露于細菌脂多糖（LPS）或熱滅活細菌可以重建堿性磷酸酶活性，但不影響對聚糖的表達，表明存在不同的宿主微生物反應途徑。據報道，斑馬魚腸道中的上皮細胞增殖通過駐留微生物群的存在和Wnt信號轉導的激活來刺激。他們表明，穩(wěn)態(tài)先天免疫反應，但不是炎癥信號有助于上皮增生的影響，因為微生物對上皮細胞的周轉需要MYD88，而不是TNF受體。這也與小鼠發(fā)現(xiàn)一樣，細菌刺激誘導斑馬魚細胞中NF-κB（免疫基因表達的關鍵調節(jié)因子）。無菌性斑馬魚激活NF-κB的細菌定植及其在腸和腸外組織中的靶基因表達。在腸道菌群建立過程中，誘導刷毛酶堿性磷酸酶的表達。除了其在消化中的作用，表明缺乏堿性磷酸酶的斑馬魚對LPS毒性敏感，并且顯示腸中性粒細胞水平升高。這些發(fā)現(xiàn)說明微生物在斑馬魚腸道中形成中性粒細胞的穩(wěn)態(tài)水平。對小鼠堿性磷酸酶活性的進一步研究表明，它也具有先前未知的免疫功能。

適應性免疫：在早期，斑馬魚完全依賴于它們固有的免疫系統(tǒng)，這使得在沒有適應性免疫的情況下研究先天免疫過程。以前認為適應性免疫系統(tǒng)直到4周后才成熟。因為胸腺和頭腎（初級免疫器官）在早期幼蟲階段仍然是基本的。斑馬魚胸腺僅從4 WPF開始獲得更復雜的形狀，髓質中的TCRα恒定區(qū)陽性細胞在2～3 WPF中可見。在2 WPF時檢測到頭腎RAG-1的表達。原位雜交法報告9日齡斑馬魚食管和腸中的部分TCR陽性細胞?？傊?，對于達到B和T細胞室功能成熟的年齡的證據仍然是有限的。LAM和同事們發(fā)現(xiàn)，在4 WPF之前，不能觀察到T細胞非依賴性和T細胞依賴性的免疫應答（IgM）。表明斑馬魚免疫系統(tǒng)中的IgM反應在形態(tài)和功能上成熟于4～6 WPF。然而，這些研究是在鑒定IGZ之前進行的。IGZ-2轉錄物已經檢測到2 WPF，這可能表明這種反應的快速發(fā)展。根據這些數據，目前比較安全的說法是，在生命的前兩周，斑馬魚僅僅依靠先天免疫機制來防御。

先天免疫：抗菌肽（AMPS），由腸上皮細胞產生，在幼蟲斑馬魚腸道形成第一道防線。AMPS是一種有效的廣譜抗菌藥物。AMPS是能殺死革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌、包膜病毒、真菌甚至轉化或癌細胞的有效的廣譜抗菌劑。在斑馬魚中，與其他魚類一樣，一些基因被復制和多樣化，這可能導致這些細胞因子亞型的不同功能。有趣的是，與小鼠相反，斑馬魚具有CXCL8（IL-8），其與人CXCL8的功能相似。CXCL8是一種能吸引中性粒細胞的有效趨化因子。斑馬魚CXCL8在白細胞和腸上皮細胞中表達。已經證明，CXCL8L1（CXCL8A）在腸中的表達隨時間動態(tài)變化。檢測到在1 WPF和成人年齡（14 WPF）的低表達水平，但在5 WPF中在分散的粒細胞和上皮細胞中的表達增加。在5 WPF的RAG1缺陷斑馬魚中，CXCL8A的表達增加，而原位雜交只顯示一些分散的細胞的染色，而它們的上皮細胞是陰性的。原始巨噬細胞也出現(xiàn)在血液循環(huán)開始之前。這些原始巨噬細胞遷移到大腦形成小膠質細胞，但能夠吞噬并殺死被注射的細菌。標記巨噬細胞的MPEG1轉基因斑馬魚特異性地顯示巨噬細胞存在，盡管在整個胚胎包括小腸的28 HPF中的數量較低，并且隨時間增加。最近，通過使用巨噬細胞表達腫瘤壞死因子α（TNFA）的轉基因株系，Nguyen Chi和同事報告了巨噬細胞亞群的存在。

腸道炎癥：為了充分利用斑馬魚的優(yōu)勢，有幾個群體使用斑馬魚幼蟲和成蟲開發(fā)了腸道炎癥模型。隨著不同的先天免疫細胞的轉基因報告魚的發(fā)展，首次在健康和腸道炎癥期間可以監(jiān)測細胞募集。甚至在大多數轉基因斑馬魚可用之前，F(xiàn)leming和他的同事就用實驗小鼠模型中的半抗原2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）開創(chuàng)了斑馬魚腸道炎癥的領域。從3到8 dPF，將魚浸泡在75μg/mL的TNBS中，觀察到擴張的腸腔，腸皺襞（絨毛）消失，杯狀細胞數量增加和5 DPF的上皮細胞出現(xiàn)上皮壞死因子α（TNF-α）陽性染色。強的松和5-氨基水楊酸是IBD患者的兩種藥物，改善了斑馬魚幼蟲中TNBS誘導的疾病。這證實了與人類疾病狀態(tài)相關的腸道生理學和病理學可以在斑馬魚幼蟲中進行建模。浸泡在TNBS溶液中（50μg/ml 3天）的幼蟲表現(xiàn)出明顯的促炎標記物MMP9和白細胞增多。由于幼蟲浸泡不僅會對腸道造成損害，而且會對皮膚造成損害，因此他們優(yōu)化了方案，僅誘導腸道損傷而無皮膚損傷。幼蟲暴露于75μg/ml TNBS三天，表現(xiàn)出廣泛的皮膚損傷。暴露于低劑量TNBS或75μg/ml劑量的幼蟲在三天內未出現(xiàn)皮膚損傷。在TNBS暴露的幼蟲中觀察到增殖細胞數量的顯著增加。，與小鼠和人類一樣，小腸結腸炎依賴于微生物群和Toll樣受體信號，因為敲除MyD88導致TNBS暴露的死亡率增加。在后續(xù)研究中，奧赫勒和他的同事們用DSS開發(fā)了另一種小腸結腸炎模型，并將小腸結腸炎與TNBS誘導的小腸結腸炎進行了比較。DSS模型，如TNBS模型顯示嗜中性粒細胞炎癥，依賴于微生物。然而，DSS模型也顯示出與TNBS誘導模型的顯著差異：DSS誘導的結腸炎顯示細菌過度生長，因為從整個幼蟲勻漿中的細菌計數比未處理或TNBS處理的幼蟲在暴露3天之后顯示出更高的計數。暴露于TNBS后3天暴露的一氧化氮（NO）的增加在幼蟲暴露于DSS時是不可見的。

結論：斑馬魚模型不僅可以用于研究人類疾病的潛在途徑，它還可以作為研究水產養(yǎng)殖魚類如大西洋鮭魚食物誘發(fā)腸道炎癥的一個重要模型。