TEL:17312606166（魏經(jīng)理）
美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
摘要：斑馬魚已經(jīng)在發(fā)育生物學和藥物遺傳學中成為流行的模式生物。結(jié)合強大的遺傳和轉(zhuǎn)基因工具，透明的胚胎和快速的幼體發(fā)育，斑馬魚的研究允許對許多動態(tài)過程進行詳細的細胞分析。近幾十年來，利用斑馬魚模型對性腺發(fā)育過程中的細胞和分子機制進行了深入的研究。我們簡要概述了這些研究，并重點介紹了斑馬魚性別確定和性腺發(fā)育中涉及的必需基因。
關(guān)鍵詞：性腺發(fā)育 斑馬魚 基因
簡介：在動物中，存在兩種不同的性別，這對于有性繁殖和物種的生存至關(guān)重要。 然而，性別決定的機制是變化多端且人們對其知之甚少。與大多數(shù)其他高度保守的發(fā)育過程相反，沒有一個基因網(wǎng)絡(luò)可以控制所有物種的性別決定。斑馬魚作為研究生物越來越受歡迎，特別是在胚胎發(fā)育研究和疾病模型方面。Cas9相關(guān)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和單細胞RNA序列分析的最新進展也為了解特定魚類的性別決定和性腺發(fā)育的細胞事件提供了機會。這些數(shù)據(jù)使我們能夠?qū)唏R魚中的性腺發(fā)育與其他動物中的性腺發(fā)育進行比較。
斑馬魚的性別確定和性腺發(fā)育：脊椎動物的雄性和雌性生殖道來自同一胚胎組織。 性別決定是指性腺分化為睪丸或卵巢所涉及的關(guān)鍵事件。在斑馬魚中，性腺的發(fā)育首先經(jīng)歷了卵巢樣階段。 受精后第10天（dpf），所有性腺中均可發(fā)現(xiàn)早期卵母細胞。雖然直到15dpf才出現(xiàn)有絲分裂活動的跡象，但早期的二倍體卵母細胞可以觀察到一個清晰的幼年卵巢結(jié)構(gòu)，這表明脊椎動物卵子早期發(fā)生。Selman等人根據(jù)斑馬魚卵巢的形態(tài)和核型，將斑馬魚的卵子發(fā)生過程分為五個階段?；诖耍詣e分化的特征是出現(xiàn)核周卵母細胞，最早出現(xiàn)在17 dpf。在21 dpf時在性腺中出現(xiàn)這兩種分化模式，而在22 dpf時一些性腺開始減數(shù)分裂。依賴于多種信號網(wǎng)絡(luò)，大約一半的幼年卵巢維持著卵子發(fā)生的途徑，另一半的個體經(jīng)歷凋亡，啟動“幼年卵巢到睪丸”的性腺轉(zhuǎn)化過程，最終轉(zhuǎn)化為睪丸。到25 dpf時，仍然是雙性。31 dpf可觀察到性腺的三種形態(tài)，包括有核周卵母細胞的幼年卵巢、成熟卵母細胞的假定卵巢、卵母細胞凋亡并發(fā)育精原囊腫的假定睪丸。在40 dpf時，雌性性腺在卵子發(fā)生的各個階段都含有生殖細胞，而在其他性腺中，退化卵母細胞被觀察到并被認為是生精活動的第一個跡象。
圖1、斑馬魚性腺發(fā)育過程中的基因網(wǎng)絡(luò)。不同的基因在不同的階段扮演著重要的角色，完成性別決定和性腺發(fā)育的復雜生命過程。不同顏色或形狀的圖形表示不同類型的細胞。
斑馬魚生殖發(fā)育的基因網(wǎng)絡(luò)：性別確定機制主要可以分為兩種，遺傳性別確定（GSD）和環(huán)境性別確定（ESD）。 GSD可以具有單基因或多基因基礎(chǔ)。XX / XY系統(tǒng)和ZZ / ZW系統(tǒng)是GSD的兩個典型系統(tǒng)。 魚類中存在多種性別決定機制，包括GSD，ESD或GSD-ESD相互作用。斑馬魚沒有所謂的“異形性染色體”，它決定人類和其他幾種物種的性別。斑馬魚表現(xiàn)出多基因的性別決定，也受到環(huán)境的影響。實驗室品系缺乏明確的與性相關(guān)的性染色體位點，但印度的野生株在Chr4上具有位點，可作為具有環(huán)境影響的ZZ / ZW性染色體系統(tǒng)。研究人員已經(jīng)知道環(huán)境因素，例如水溫，可以改變斑馬魚種群的性別比。但是，涉及性別確定的基因網(wǎng)絡(luò)仍然不清楚，有時還存在爭議。 在這里，我們總結(jié)了對斑馬魚的性別決定和性腺發(fā)育至關(guān)重要的基因。
生殖細胞特異性基因：
多細胞生物有性生殖需要正確的生殖細胞規(guī)格和維持。雖然生殖細胞的規(guī)格因物種而異，但分子因子基本上是保守的。vasa和dnd1（以前的名稱：dnd）始終用作生殖細胞特異性標記。 在卵裂期檢測到母源性vasa和dnd1。 已經(jīng)表明，這兩個基因的表達對于生殖細胞的遷移，存活和維持至關(guān)重要。Piwi基因已被鑒定為負責干細胞和生殖細胞分化的調(diào)節(jié)蛋白。在斑馬魚中，Piwi同源物piwil1和piwil2在雄性和雌性性腺中都表達。 piwil1在胚胎生殖和成年性腺的原代生殖細胞中表達，與vasa共定位。據(jù)Houwing等人報道，在幼蟲發(fā)育過程中piwil1的缺失會觸發(fā)生殖細胞凋亡。與piwil1一樣，piwil2的丟失也有顯著的影響，導致生殖細胞無法分化成成熟的卵母細胞或精子。編碼母體mRNA的nanos1在早期胚胎發(fā)育階段在PGC中表達，對PGC的存活和遷移至關(guān)重要。已證明Tudor結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（Tdrds）充當Piwi相互作用蛋白，參與精子發(fā)生。缺乏tdrd12的魚類顯示出的生殖細胞數(shù)量減少，最終35 dpf時損失生殖細胞。 此外，在tdrd12突變體衍生的生殖細胞中也觀察到減數(shù)分裂缺陷。這些基因的正確表達對PGCs的健康形成和性腺的正常發(fā)育至關(guān)重要。純合子敲除斑馬魚或這些生殖細胞特異基因的突變體（vasa、dnd1、piwil1、piwil2、nano1和tdrd12）通常都是雄性的，睪丸呈線狀；雖然這些魚可以與雌性交配并刺激產(chǎn)卵，但卵沒有受精。另外，ca15b在早期胚胎的PGCs中表達，其表達與vasa相似，表明ca15b是PGCs發(fā)育所必需的。另外，dyrk1a的表達始于2細胞期，并存在于斑馬魚囊胚期的所有細胞中，這與PGCs的正常形成有關(guān)。dyrk1a的過度表達導致與PGCs發(fā)育相關(guān)的兩個重要因子ca15b和piwil1的表達降低，導致PGCs數(shù)量減少和遷移紊亂。斑馬魚dyrk1a與人類DYRK1A高度保守，這項工作可能為唐氏綜合癥患者的生殖細胞缺陷提供可能的機制。
睪丸相關(guān)基因：
睪丸的正確分化和發(fā)育是生殖的基本前提。sox9a，dmrt1，amh，ar和hsf5基因在斑馬魚的“卵巢到睪丸”階段和睪丸成熟后期階段中起著重要作用，所有這些對于正確分化和發(fā)展睪丸至關(guān)重要。SRY-box轉(zhuǎn)錄因子9a（sox9a）在斑馬魚體內(nèi)的表達在18dpf時達到第一個高峰，下一個高峰與ar表達高峰在22dpf時一致，此時雙潛能性腺開始向卵巢或睪丸分化。在睪丸中，sox9a被證明是amh的上游正調(diào)節(jié)劑和cyp19a1a的上游負調(diào)節(jié)劑。Webster等人證明了doublesex和與mab-3相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子1（dmrt1）對于睪丸的發(fā)育是必不可少的，但對于卵巢的發(fā)育則是不必要的； dmrt1還通過amh和foxl2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控促進雄性發(fā)育?？筂üllerian激素（amh）是影響雄性性腺發(fā)育的重要因素。它對Müllerian導管的退行以及控制雄性生殖細胞增殖和分化的平衡具有重要意義。雄激素受體（ar）與雄激素相互作用，在雄性發(fā)育中發(fā)揮功能。 ar的轉(zhuǎn)錄本在16 dpf和22 dpf時達到峰值，隨后在推測的雄性發(fā)育階段均保持在較高的穩(wěn)定水平，這表明它對于雄性分化和維持至關(guān)重要。Saju等。 發(fā)現(xiàn)熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族成員5（hsf5）的表達從35dpf開始增加，在雄性精子發(fā)生和生育的早期階段起著重要作用?？傊?，純合子敲除斑馬魚或這些睪丸相關(guān)基因（dmrt1、amh和ar）的突變體通常表現(xiàn)出雌性偏向的性別比例。特別地，sox9a的異常表達可以阻止斑馬魚幼魚的卵巢-睪丸轉(zhuǎn)化。 缺乏dmrt1表達的雄性腺會導致amh基因表達受損，從而使foxl2基因的表達不再受到限制。相反，在這些dmrt1突變體中，雌性卵巢發(fā)育正常。在純合型amh突變雄性中，由于生殖系的不可控增殖和分化缺陷，可觀察到睪丸肥大，生殖細胞增多，精子較少。無ar雄性斑馬魚具有雌性次生性特征，不育，睪丸較小，精子發(fā)生受阻。hsf5-/-突變型雄性不育，精子數(shù)量減少，精子形態(tài)異常，精子活力降低，但是雌性可育。
卵巢相關(guān)基因：
產(chǎn)生卵子并分泌雌激素的卵巢是雌性腺的核心。 諸如cyp19a1a，foxl2，fancl，ca15b，nanos1，nanos2和nanos3等基因共同調(diào)節(jié)卵巢的正確形成和功能。sox9a的低表達或無表達阻止雙潛能性腺發(fā)育成雄性性腺；隨后，性腺開始向雌性分化，cyp19a1a表達增加。cyp19a1a基因編碼的芳香化酶限制了從睪丸激素向雌激素的轉(zhuǎn)化速率，并且在性別分化過程中起著雙重作用：cyp19a1a的低表達對于睪丸分化是必需的，而cyp19a1a的高表達對于卵巢分化和維持雌性至關(guān)重要。foxl2對于哺乳動物卵巢發(fā)育和維持至關(guān)重要。 斑馬魚中有兩個foxl2同源基因，分別名為foxl2a和foxl2b。在卵巢分化和發(fā)育過程中，foxl2a的表達高于foxl2b，成熟卵巢中foxl2b的表達更為豐富。foxl2a和foxl2b的功能是相輔相成的，它們共同調(diào)節(jié)卵巢的發(fā)育和維持，而foxl2b在卵巢維持和預防轉(zhuǎn)化雄性中起著更具體的作用。fancl，F(xiàn)anconi / BRCA DNA修復途徑的成員，在發(fā)育中的卵母細胞和精母細胞中表達。 特別是，fancl通過減數(shù)分裂使卵母細胞前進，同時維持cyp19a1a表達并下調(diào)amh表達，對卵巢的分化和發(fā)育至關(guān)重要。此外，如前所述，ca15b在早期胚胎的PGC中表達。 Wang等人還發(fā)現(xiàn)ca15b在成年雌性的卵母細胞中表達，這表明ca15b可能在卵子發(fā)生中具有重要作用。此外，在雌性性腺發(fā)育過程中，nanos1的表達對于維持卵母細胞的生成是必需的。nanos2和nano3對維持卵巢生殖系干細胞（GSCs）很重要。
這些卵巢相關(guān)基因的異常表達可導致各自的異常表型。cyp19a1a缺失突變斑馬魚雌激素的生物合成是有缺陷的，雖然雄性cyp19a1a突變體是可育的，但雌激素的作用會導致卵巢樣性腺在性別分化過程中消失，并導致所有雄性的性別分化延遲。此外，cyp19a1a表達失調(diào)導致其他基因如sox9a、amh、dmrt1和foxl2在性腺分化期的異常表達。foxl2a突變純合子具有正常的1：1性別比，而foxl2b破壞會導致成年雌性部分性逆轉(zhuǎn)。 foxl2a-/-和foxl2b-/-突變體最初都執(zhí)行正常的卵巢分化和卵母細胞發(fā)育。然而，成熟后，睪丸相關(guān)基因（sox9a、amh和dmrt1）表達增加，而與之相反，卵巢相關(guān)基因cyp19a1a在foxl2a–/–或foxl2b–/?雌性突變體中表達減少。雌性成年斑馬魚的卵巢加速老化和卵母細胞減數(shù)分裂異常，與人類患者卵巢早衰（POF）相關(guān)的情況相似。在斑馬魚中，一些foxl2b–/?純合子雌性突變體從180 dpf開始發(fā)生性反轉(zhuǎn)。此外，foxl2b基因缺陷的雌性同時出現(xiàn)了性反轉(zhuǎn)。fancl純合突變體由于雌雄性反轉(zhuǎn)而發(fā)育為所有可育雄性。異常凋亡導致卵母細胞缺失，雌性特異性基因（如cyp19a1a）表達無法維持，雄性特異性基因（如amh）表達上調(diào)。另外，nanos1突變體雌性在受精后6個月完全不育，而nano3突變體成年雌性最初是可育的，但在5個月后轉(zhuǎn)變?yōu)椴挥?/p>
其他重要基因：
除上述基因外，還有一些基因在雄性和雌性斑馬魚的發(fā)育過程中起著重要作用，調(diào)節(jié)它們性腺的發(fā)育。這里我們介紹brca2、cyp17a1和cyp11c1的功能。斑馬魚fancd1（brca2）和fancl與人類FANCD1（BRCA2）和FANCL同源，在結(jié)構(gòu)和功能上均保守。它們是Fanconi Anemia（FA）基因中的兩個，有助于DNA修復和維持基因組穩(wěn)定性。上面已經(jīng)描述了fancl的功能。brca2在斑馬魚發(fā)育期卵母細胞和成熟卵母細胞中均有表達，而在睪丸中，brca2在精原細胞和發(fā)育精母細胞中均有表達，但在成熟精子中不表達。brca2是建立或維持卵母細胞核結(jié)構(gòu)所必需的，對卵巢發(fā)育至關(guān)重要。所有純合的brca2成年突變體均為男性，這是由于卵母細胞在幼年期未能通過減數(shù)分裂而進展，導致雌性至雄性逆轉(zhuǎn)。
cyp17a1參與產(chǎn)生雌激素和雄激素的類固醇生成途徑，對斑馬魚的性發(fā)育具有重要意義。雄性激素是睪丸發(fā)育所必需的，維持雄性典型的第二性征和正常的交配行為。同時，雌激素對卵巢分化是必不可少的。cyp17a1缺乏的斑馬魚都是雄性，因為雌激素的生物合成受阻。同時，雄性也表現(xiàn)出雌性的特征，包括淺黃色的肛鰭著色和深黑色的身體色素沉著，以及失去平行游泳和抓握的能力，導致雌性產(chǎn)卵失敗，這是由于雄激素合成受損造成的。
斑馬魚cyp11c1編碼11β-羥化酶，對11-酮睪酮（11-KT）和皮質(zhì)醇的生物合成具有重要作用。Zhang等人發(fā)現(xiàn)cyp11c1在30和35dpf時都在睪丸和卵巢中表達，然后在45 dpf后在睪丸中特異表達。與野生型相比，cyp11c1–/?魚類的性別比沒有顯著差異。
綜上所述，這些優(yōu)勢意味著未來斑馬魚旨在了解復雜性腺發(fā)育的工作將有可能支持和改善我們的生理病理學知識，對人類具有診斷和治療潛力。
原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2001037020303780
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