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病態(tài)竇房結(jié)綜合征（ Sick Sinus Syndrome, SSS），又稱竇房結(jié)功能障礙，是指心臟的天然起搏器（竇房結(jié)）不能夠正常產(chǎn)生有節(jié)律的心律，從而導(dǎo)致心律失常的一類衰老相關(guān)的疾病。SSS 主要臨床癥狀表現(xiàn)為竇性停搏、心動(dòng)過(guò)緩或過(guò)速、以及房顫等。據(jù)估算，每 600名 65 歲以上的成年人中就有 1 例患SSS[1]；持續(xù)有癥狀性的SSS 可導(dǎo)致心臟或身體的供血不足，嚴(yán)重可引起心衰和心臟驟停，危及生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，SSS也是導(dǎo)致患者需要植入人工起搏器的最常見(jiàn)適應(yīng)癥 [2] 。SSS具有一定的家族遺傳性，可由致病基因突變所導(dǎo)致。有效分離發(fā)現(xiàn)在竇房結(jié)組織中高效表達(dá)的 SSS致病基因?qū)σ赘腥巳旱娘L(fēng)險(xiǎn)分級(jí)、疾病診斷并發(fā)展藥物治療靶點(diǎn)具有重要的理論指導(dǎo)意義。但是，基于SSS是一類與衰老相關(guān)、發(fā)展緩慢的疾病，加之其外顯率通常較低的特點(diǎn)，目前已知的SSS致病基因數(shù)量非常有限，其發(fā)病的分子機(jī)制更有待進(jìn)一步的闡明。

2022年10月18日，美國(guó)梅奧醫(yī)院徐曉雷/丁永和等團(tuán)隊(duì)合作在eLife雜志在線發(fā)表了題為“A phenotype-based forward genetic screen identifies Dnajb6 as a sick sinus syndrome gene” 的研究進(jìn)展 。該研究通過(guò)結(jié)合斑馬魚(yú)遺傳篩選和小鼠動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)并初步闡明Dnajb6是一個(gè)新的病態(tài)竇房結(jié)綜合癥致病基因。

在前期研究中，美國(guó)梅奧醫(yī)院Stephen Ekker和徐曉雷等團(tuán)隊(duì)合作，在斑馬魚(yú)模式動(dòng)物中建立了攜帶有Cre-loxP重組酶系統(tǒng)的、在轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致靶基因突變的同時(shí)，又可通過(guò)熒光蛋白標(biāo)簽來(lái)實(shí)時(shí)報(bào)告靶基因編碼蛋白的時(shí)空表達(dá)模式和細(xì)胞器精確定位的、可有條件逆轉(zhuǎn)的新型轉(zhuǎn)座子插入誘變體系[3]。利用這一體系，該團(tuán)隊(duì)收集了約1200個(gè)相關(guān)的斑馬魚(yú)突變體品系，為下一步在全基因組水平上對(duì)基因的功能注釋，以及研究人類相關(guān)疾病的分子基礎(chǔ)奠定了一定的技術(shù)和資源基礎(chǔ)。

本研究則進(jìn)一步發(fā)展該斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)座子插入誘變體系，將其應(yīng)用于心臟節(jié)律疾病相關(guān)的遺傳學(xué)研究。研究人員首先從609個(gè)斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)座子插入突變體品系中富集了35個(gè)靶基因在心臟高效表達(dá)的突變體，然后應(yīng)用心電圖技術(shù)進(jìn)行正向遺傳學(xué)篩選，成功的分離并確認(rèn)了3個(gè)突變體品系在1.5-2年齡時(shí)具有顯著增加的竇性停搏的表型，類似人類衰老相關(guān)的SSS。通過(guò)對(duì)其中一個(gè)同時(shí)具有顯著心動(dòng)過(guò)緩表型，并在心臟特異性表達(dá)熒光報(bào)告標(biāo)簽的突變體品系進(jìn)行詳細(xì)表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，編碼分子伴侶蛋白的Dnajb6突變靶基因在斑馬魚(yú)和小鼠模型的起搏器（竇房結(jié)）組織中具有非常獨(dú)特的表達(dá)和定位模式。在斑馬魚(yú)模型中，Dnajb6可定位于竇房結(jié)和房室通道（Atrio-ventricular canal）(圖1)。在小鼠模型中，Dnajb6蛋白則主要富集于竇房結(jié)，并與竇房結(jié)組織中心臟起搏細(xì)胞特異性表達(dá)的HCN4蛋白部分共定位（圖2）。這些結(jié)果表明，通過(guò)斑馬魚(yú)正向遺傳學(xué)篩選可有效分離發(fā)現(xiàn)在竇房結(jié)組織中具有獨(dú)特表達(dá)模式的新型SSS致病基因。

圖1 斑馬魚(yú)GBT4AA/dnajb6b突變體顯示竇性停搏表型，其突變靶基因編碼蛋白定位于心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)

圖2 小鼠Dnajb6蛋白定位于竇房結(jié)組織，并與起搏器細(xì)胞特異性表達(dá)的HCN4蛋白共定位，其基因敲除小鼠顯示竇性停搏以及房室傳導(dǎo)阻滯表型

為了進(jìn)一步闡明Dnajb6基因突變導(dǎo)致SSS的病理生理特征，研究人員應(yīng)用高分辨率熒光光學(xué)映射（Optical Mapping）動(dòng)作電位技術(shù)對(duì)該Dnajb6基因敲除的小鼠雜合子突變體的竇房結(jié)心臟起搏器功能進(jìn)行了詳細(xì)的電生理學(xué)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型對(duì)照相比，Dnajb6基因敲除小鼠具有明顯心動(dòng)過(guò)緩以及房室傳導(dǎo)阻滯的表型；并且，其心率表現(xiàn)為更為明顯的高度不規(guī)則性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與野生型對(duì)照小鼠中其起搏器大多位于解剖學(xué)和功能上定義的竇房結(jié)組織區(qū)域內(nèi)不同，Dnajb6基因敲除小鼠中的起搏器大多數(shù)分布于竇房結(jié)組織之外的附屬心房和房間隔等區(qū)域（圖3）。這些電生理學(xué)的實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果提示Dnajb6基因功能缺失突變可能導(dǎo)致位于竇房結(jié)組織中主導(dǎo)起搏器細(xì)胞受到一定程度的抑制所導(dǎo)致的。

圖3 Dnajb6基因敲除小鼠的起搏器較為分散，多分布于竇房結(jié)組織之外的附屬心房和房間隔等區(qū)域

研究人員進(jìn)一步結(jié)合應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、計(jì)算機(jī)模擬以及竇房結(jié)組織抗體免疫熒光染色等技術(shù)手段對(duì)Dnajb6基因突變導(dǎo)致SSS的分子作用機(jī)制進(jìn)行了初步的研究探索。首先，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)107個(gè)在Dnajb6基因敲除小鼠右心房組織中差異表達(dá)的基因。其中，鈣調(diào)蛋白、離子通道編碼相關(guān)基因以及Wnt/β-Catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白編碼基因具有明顯的富集。與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致的是，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分析發(fā)現(xiàn)Dnajb6基因敲除小鼠竇房結(jié)中最大電導(dǎo)率的L型Ca2+電流（ICa,L）、Na+/Ca2+交換器的最大傳輸速率以及T型Ca2+電流的電導(dǎo)均發(fā)現(xiàn)顯著異常。研究人員繼續(xù)通過(guò)抗體免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠的竇房結(jié)組織中，Dnajb6 與 Tbx3 蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖4）。對(duì)應(yīng)的是，在Dnajb6基因敲除小鼠中Tbx3蛋白的總體表達(dá)水平呈顯著降低趨勢(shì)。這些結(jié)果提示Dnajb6蛋白對(duì)Tbx3蛋白的表達(dá)可能具有抑制作用?？紤]到Tbx3是一個(gè)已知的決定起搏器細(xì)胞特異性的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；同時(shí)，Tbx3又是Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄元件；結(jié)合通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)Dnajb6基因敲除小鼠中鈣調(diào)蛋白和Wnt/β-Catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白編碼基因的差異表達(dá)等證據(jù)支持，研究人員設(shè)想：Dnajb6基因突變可能通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子Tbx3的表達(dá)，進(jìn)而干擾了鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡，從而導(dǎo)致竇房結(jié)自主調(diào)節(jié)機(jī)制異常的SSS致病機(jī)理。

圖4 小鼠竇房結(jié)組織中Dnajb6與Tbx3蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系

最后，為了尋求DANJB6基因突變與人SSS的臨床相關(guān)性證據(jù)，研究人員分析了一個(gè)收集了6，469例SSS病例和1，000，187例對(duì)照組的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）數(shù)據(jù)庫(kù)[4]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)DNAJB6的變異位點(diǎn)與SSS具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相關(guān)性（P<0.05）。其中最顯著的一個(gè)變異位點(diǎn)：rs754941044（P=0.0193）位于潛在的剪切受體區(qū)域。因此，該剪切受體位點(diǎn)變異很可能對(duì)DNAJB6基因的正常功能具有顯著影響。這些人類遺傳學(xué)的分析結(jié)果初步提示DNAJB6基因突變與人SSS的發(fā)生具有潛在的相關(guān)性。

綜上所述，該研究通過(guò)結(jié)合斑馬魚(yú)和小鼠動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了Dnajb6基因是一個(gè)新的病態(tài)竇房結(jié)綜合征的致病基因；該研究初步闡明了Dnajb6基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Tbx3的表達(dá)來(lái)調(diào)控鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡，從而達(dá)到自主調(diào)節(jié)竇房結(jié)起搏器正常功能的潛在分子作用機(jī)制；本研究為應(yīng)用斑馬魚(yú)正向遺傳篩選從全基因組水平上系統(tǒng)性分離發(fā)現(xiàn)更多的心臟節(jié)律疾病相關(guān)的新基因提供了一個(gè)可借鑒的思路。

該論文的通訊作者是來(lái)自美國(guó)梅奧醫(yī)院的徐曉雷教授；第一作者是美國(guó)梅奧醫(yī)院、青島大學(xué)的丁永和教授。上海交通大學(xué)新華醫(yī)院的李毅剛教授，University of Wisconsin-Madison的 Alexey Glukhov 教授，和 University of California-Davis 的 Eleonora Grandi教授參與了此項(xiàng)研究。

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