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基因型鑒定是應(yīng)用基因工程小鼠的過(guò)程中必不可少的步驟。

雖然這個(gè)工作很基礎(chǔ)，但真的常常會(huì)遇到問(wèn)題，并不是幾個(gè)字——鼠尾DNA PCR——就簡(jiǎn)單搞定了。究其原因往往在于不曾注意的細(xì)節(jié)。

也許很多人覺(jué)得整個(gè)基因型鑒定過(guò)程就只是 PCR 反應(yīng)。出了問(wèn)題就拼命回想 PCR 過(guò)程中的操作：有沒(méi)有忘加引物、忘加 DNA 模板、忘加酶，這一類“一不留神”的失誤......發(fā)現(xiàn)都OK的啊，然后就一臉茫然了......

其實(shí)，基因型鑒定中，小鼠基因組 DNA 的制備也直接決定結(jié)果的好壞。南模生物可提供小鼠基因型鑒定服務(wù)

DNA 質(zhì)量不高

為了能快速得到基因型結(jié)果，采用堿變性快速抽提 DNA 的方法，雖然過(guò)程很簡(jiǎn)單，但這樣制備的 DNA 質(zhì)量較差，很容易發(fā)生做不出結(jié)果的情況；或者使用直接 PCR 擴(kuò)增試劑盒（將鼠尾在試劑中浸泡20分鐘后取上清直接作為模板），由于試劑盒選擇的種類比較多，不是所有的基因型鑒定方案都適合這種方式，特別是不同廠家的試劑盒擴(kuò)增效率也不一樣，如果發(fā)生 PCR 結(jié)果不理想的狀況，還是建議用傳統(tǒng)的 DNA 提取方法，先獲得高純度 DNA 模板，再進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。

綜合時(shí)間成本與成功率兩大因素，利用裂解液加蛋白酶K配方裂解鼠尾，釋放 DNA，并通過(guò)酒精沉淀的方法得到純度較高的DNA，是高效簡(jiǎn)便的小鼠基因組 DNA 制備方法。

小鼠基因組抽提Protocol

蛋白酶K貯存液的配制：用超純水徹底溶解蛋白酶K粉劑, 使終濃度為10mg/ml，分裝成1ml/vial, -20度保存。裂解液的主要成分：SDS、EDTA、Tris/HCl、NaCl。小鼠尾基因組DNA提取步驟：（1）剪取小鼠尾端約0.5厘米（視鼠齡及鼠尾粗細(xì)可調(diào)整, 盡量使鼠尾體積相互接近），將鼠尾放入已編號(hào)1.5ml離心管中并蓋好蓋子。（2）每管加0.5ml裂解液和50μl蛋白酶K貯存液并將蓋蓋緊。 （3）將離心管置于雜交管中并用紙團(tuán)稍加固定。（4）將離心管置雜交爐中，56℃轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)夜。（5）次日將樣本于室溫，12000rpm離心 10分鐘。（6）上清倒入1.5ml 離心管中，加1ml 無(wú)水乙醇（約2倍上清體積），蓋緊蓋子后輕搖，可見(jiàn)絮狀沉淀。13000rpm, 15min,棄上清。（7）加70%乙醇1ml，洗滌，13000rpm離心10~15min，棄上清，收集沉淀，室溫晾10~15min。 （8）每管加80~100μl 滅菌水，蓋好后置室溫或37℃一小時(shí)充分溶解。在室溫中放置數(shù)小時(shí)，待DNA全部溶解后-20℃保存，或直接進(jìn)行PCR或雜交等實(shí)驗(yàn)。如DNA溶解不完全,在37℃水浴中放置30~60min，但不可過(guò)夜。DNA樣品的OD260/280在1.8-2.0之間。注意：裂解鼠尾一定要充分，有條件盡量使用雜交爐。因?yàn)槿绻呀膺^(guò)程中組織與裂解液始終保持靜止，而沒(méi)有翻轉(zhuǎn)的過(guò)程，這會(huì)導(dǎo)致DNA和鼠毛之類的雜質(zhì)沒(méi)有完全分開(kāi)。離心去除雜質(zhì)的過(guò)程中，DNA就會(huì)隨著這些雜質(zhì)一起被拋棄了。

DNA 模板濃度過(guò)高

做人不能太貪心。DNA 模板不是越多越好的。一般建議將模板濃度控制在50-100ng/μl 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

PCR 酶不合適

DNA 質(zhì)量很好，濃度也控制在標(biāo)準(zhǔn)濃度，PCR 還是做不出來(lái)，原因可能是 PCR 酶沒(méi)有選擇好，不同的 PCR 產(chǎn)物 GC 含量不一樣，遇見(jiàn) GC 含量很高的產(chǎn)物往往常規(guī)的 PCR 酶沒(méi)法做出很好的結(jié)果。一般在定制的基因工程小鼠鑒定方案中會(huì)指出適合的 PCR 酶的貨號(hào)，按照已驗(yàn)證的方案以及推薦的酶體系，一般不會(huì)出錯(cuò)?？匆豢椿蚬こ绦∈蟮蔫b定方案一般長(zhǎng)什么樣子：

Tips：

上面的電泳圖中你是不是發(fā)現(xiàn)了什么？為什么轉(zhuǎn)基因 Cre 小鼠的鑒定結(jié)果會(huì)有兩條帶？除了待檢測(cè)的樣品以外，還有兩個(gè) Control 對(duì)照孔？沒(méi)錯(cuò)！這里小編要提醒大家，對(duì)照 Control 的設(shè)置非常重要！這恰恰是很多同學(xué)所忽略的。在一般的 Genotyping 里面，每一次鑒定至少要設(shè)置一個(gè) WT Control 和一個(gè) H2O，也就是 Blank Control。WT Control 的意義：1）幫助我們快速判斷基因型。在 Flox 小鼠或片段 knockin 小鼠的鑒定中，如果產(chǎn)物條帶僅有一條或其中有一條與 WT Control 一致，那么可以判斷該樣本為 WT 或 雜合子。2）幫助我們判斷 PCR 體系是否 work。如果 PCR 產(chǎn)物在跑電泳的時(shí)候連WT Control 的樣品都沒(méi)有出條帶，那么說(shuō)明 PCR 體系有問(wèn)題，需要做相應(yīng)的調(diào)整，比如考慮更換引物或 PCR mix 等。Blank Control 的意義：H2O 對(duì)照主要是用來(lái)質(zhì)控 PCR 體系是否發(fā)生了污染。如果 H2O 對(duì)照都有條帶，說(shuō)明整個(gè) PCR 體系存在污染的問(wèn)題，這個(gè) PCR 結(jié)果不可信。Internal Positive Control Primers 的意義：Internal Positive Control 一般用在隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定中。通常轉(zhuǎn)基因鑒定引物是只針對(duì)插入的外源 DNA 序列的，所以沒(méi)有發(fā)生隨機(jī)整合的小鼠 DNA 模板不會(huì)有 PCR 產(chǎn)物產(chǎn)生。這樣一來(lái)很容易發(fā)生假陰性的問(wèn)題。也就是說(shuō)電泳沒(méi)有條帶，我們無(wú)法判斷到底是外源基因未整合的陰性結(jié)果，還是由于 PCR 體系本身的問(wèn)題造成陰性結(jié)果。所以需要另一對(duì)在所有小鼠中都能獲得 PCR 產(chǎn)物的陽(yáng)性對(duì)照引物作為內(nèi)控，即Internal Positive Control，用于判定 PCR 體系和模板質(zhì)量是否合適。

PCR 儀

如果 PCR 儀長(zhǎng)期未做溫度校準(zhǔn)，那么儀器顯示的溫度和實(shí)際溫度就存在差異。即使拿到定制小鼠的鑒定方案，還是建議在自己常用的PCR儀上摸一個(gè)退火溫度的溫度梯度，找到最合適的PCR退火溫度再進(jìn)行整體 PCR 鑒定。