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美鳳力臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心
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華中科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院史岸冰課題組在 Nature Aging 期刊發(fā)表了題為：Age-associated decline in RAB-10 efficacy impairs intestinal barrier integrity 的研究論文，闡釋了細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸效能在衰老相關(guān)的生理學(xué)變化中如何影響腸道屏障完整性。
Nature Aging 期刊還同期發(fā)表了來(lái)自中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心沈義棟研究員的News & Views文章，介紹了這項(xiàng)研究的科學(xué)意義與創(chuàng)新性。
腸道在生物體與外部威脅（如微生物和毒素）相互作用中扮演著關(guān)鍵的屏障角色。然而，隨著年齡的增長(zhǎng)，動(dòng)物和人類(lèi)的腸道功能逐漸減弱，腸道屏障功能障礙可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括炎癥性腸病、慢性心力衰竭和哮喘。研究顯示，延長(zhǎng)壽命的干預(yù)措施，如降低環(huán)境溫度或限制飲食，可以延緩動(dòng)物腸道屏障功能的下降。近期，通過(guò)對(duì)模式生物秀麗線蟲(chóng)的研究，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，線蟲(chóng)中的熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF-1喪失，導(dǎo)致ACT-5肌動(dòng)蛋白磷酸化水平上升，加速了腸道頂膜端微絲骨架網(wǎng)絡(luò)的衰退，損害了腸道屏障功能。
腸上皮屏障功能障礙的一個(gè)關(guān)鍵特征是其無(wú)法維持選擇性通透性，這在衰老過(guò)程中較為普遍。比如，老齡大鼠腸絨毛微血管的通透性明顯增加；老年人群小腸屏障的滲透性增加，導(dǎo)致與年齡相關(guān)的免疫紊亂。通過(guò)在模式系統(tǒng)中開(kāi)展的研究，學(xué)界認(rèn)識(shí)到腸上皮屏障的通透性與細(xì)胞間連接的結(jié)構(gòu)和功能完整性密切相關(guān)。
脊椎動(dòng)物腸細(xì)胞間連接包括緊密連接和粘附連接，參與維持腸道屏障的完整性和細(xì)胞間通訊。秀麗線蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物的腸上皮細(xì)胞間連接在組成和功能上相似。線蟲(chóng)腸上皮具有單一的頂膜端連接，其功能兼顧緊密連接和粘附連接，是闡明細(xì)胞連接組裝和功能的理想研究模型。線蟲(chóng)頂膜端連接包含三個(gè)主要的組成域（圖1）：頂膜端區(qū)、粘附連接域和DLG-AJM域。其中，粘附連接域的cadherin-catenin復(fù)合物由HMR-1/cadherin、HMP-2/β-catenin、HMP-1/α-catenin和JAC-1/p120組成，DLG-AJM域位于粘附連接域的基膜側(cè)，可能參與調(diào)節(jié)屏障通透性。2018年，史岸冰課題組針對(duì)HMP-1/α-catenin分布調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn)，為了將HMP-1精確定位到頂膜端連接區(qū)，必須精確地調(diào)節(jié)內(nèi)吞循環(huán)調(diào)控因子RAB-10/Rab10的活性。當(dāng)干擾RAB-10的活化時(shí)，會(huì)導(dǎo)致HMP-1在側(cè)膜上異常分布，引發(fā)側(cè)膜紊亂和過(guò)度延伸。
SDPN-1是哺乳動(dòng)物PACSINs和果蠅Syndapin的線蟲(chóng)同源物，已知促進(jìn)內(nèi)吞體上肌動(dòng)蛋白聚合。在成年小鼠中，PACSIN2位于腸細(xì)胞的頂膜，調(diào)節(jié)內(nèi)吞作用和微絨毛形態(tài)。
研究表明，SDPN-1和RAB-10之間存在潛在功能關(guān)系。SDPN-1缺失會(huì)導(dǎo)致RAB-10在細(xì)胞質(zhì)中累積，而RAB-10的缺失會(huì)導(dǎo)致SDPN-1在細(xì)胞質(zhì)中擴(kuò)散，提示SDPN-1是RAB-10功能的潛在負(fù)調(diào)控因子，而RAB-10是SDPN-1的潛在膜招募因子。然而，本研究發(fā)現(xiàn)SDPN-1的膜定位實(shí)際上并不是由RAB-10決定，RAB-10缺失細(xì)胞中的SDPN-1彌散結(jié)構(gòu)是內(nèi)吞體形成之前的簇狀前體膜結(jié)構(gòu)，SDPN-1仍附著于這些膜結(jié)構(gòu)，并非是蛋白的細(xì)胞質(zhì)彌散。RAB-10缺失后SDPN-1的膜質(zhì)比并沒(méi)有發(fā)生變化，無(wú)論有無(wú)RAB-10存在SDPN-1始終與膜標(biāo)記物PI(4,5)P2有很好的共定位。上述證據(jù)表明，SDPN-1的內(nèi)吞體膜定位主要由磷酸肌醇PI(4,5)P2決定，RAB-10與SDPN-1膜募集無(wú)關(guān)。
進(jìn)一步，研究人員發(fā)現(xiàn)衰老動(dòng)物腸道通透性的增加主要是由于粘附連接的結(jié)構(gòu)與功能障礙所致，這與RAB-10缺失造成腸道通透性增加表型一致，提示RAB-10效能在衰老線蟲(chóng)中降低，導(dǎo)致腸道粘附連接完整性受損，且RAB-10功能下降很可能與SDPN-1有關(guān)。與此推論一致，SDPN-1的表達(dá)在衰老動(dòng)物中出現(xiàn)大幅度上調(diào)，SDPN-1缺失可導(dǎo)致RAB-10及其GEF蛋白DENN-4在內(nèi)吞體上積累，而SDPN-1過(guò)表達(dá)會(huì)造成RAB-10和DENN-4內(nèi)吞體標(biāo)記水平降低。綜合這些證據(jù)，表明SDPN-1確實(shí)是RAB-10功能的負(fù)調(diào)控因子。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SDPN-1僅與無(wú)活性形式的RAB-10(GDP)相互作用，且與RAB-10存在弱共定位，SDPN-1與DENN-4的DENN結(jié)構(gòu)域有相互作用，與DENN-4有非常好的共定位。
為了解RAB-10、SDPN-1和DENN-4/GEF三者之間的功能關(guān)系，研究人員通過(guò)蛋白體外競(jìng)爭(zhēng)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(F?rster resonance energy transfer, FRET)等多類(lèi)型實(shí)驗(yàn)表明SDPN-1與DENN-4/GEF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAB-10，進(jìn)而抑制RAB-10的激活。進(jìn)一步，研究人員通過(guò)AlphaFold2-Multimer預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了SDPN-1與DENN-4競(jìng)爭(zhēng)RAB-10(GDP)上的結(jié)合界面，降低了DENN-4的GEF效能。
研究提示，SDPN-1/PACSINs可以通過(guò)其F-BAR結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的自我互作形成寡聚物。為此，研究人員通過(guò)粒徑排除色譜法（size exclusion chromatography，SEC）和多角度光散射（multi-angle light scattering，MALS）聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)SDPN-1存在二聚和六聚兩種寡聚態(tài)。蛋白互作實(shí)驗(yàn)表明，SDPN-1主要利用其二聚體形式與DENN-4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAB-10(GDP)，而六聚體可能是細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)藏庫(kù)或自我約束形式。與上述生化、生物物理研究結(jié)論一致，SDPN-1敲低可緩解衰老相關(guān)的粘附連接完整性及腸屏障通透性異常。
最后，研究人員發(fā)現(xiàn)SDPN-1對(duì)RAB-10的抑制作用需要KGB-1/JUN激酶，年齡相關(guān)的KGB-1/JUN活性抑制解除是SDPN-1行使RAB-10抑制效能的必要條件，KGB-1可能通過(guò)改變SDPN-1的寡聚態(tài)來(lái)增強(qiáng)其抑制效能。
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