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在這項(xiàng)研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)了與自閉癥密切相關(guān)的MEF2C基因上一個(gè)新的致病位點(diǎn)p.L35P。在這個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生突變的小鼠產(chǎn)生了與自閉癥相似的癥狀。隨后，研究者們開(kāi)發(fā)了一款能夠直接編輯單個(gè)堿基的基因編輯器，將其嵌入病毒外殼中并給基因突變的小鼠注射，使突變的基因成功得到糾正，改善了小鼠的自閉癥行為。
2023年11月27日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院松江研究院/中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）仇子龍團(tuán)隊(duì)與復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院程田林團(tuán)隊(duì)合作在國(guó)際神經(jīng)科學(xué)權(quán)威期刊《自然·神經(jīng)科學(xué)》（NatureNeuroscience）上發(fā)表題為《全腦體內(nèi)基因編輯逆轉(zhuǎn)了Mef2c變異小鼠的行為變化》（Whole-braininvivobaseeditingreversesbehavioralchangesinMef2cmutantmice）的研究論文，首次報(bào)道了在全腦范圍內(nèi)利用單堿基編輯技術(shù)成功改善Mef2c自閉癥小鼠模型神經(jīng)發(fā)育與自閉癥樣核心行為表型。
在這項(xiàng)研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)了與自閉癥密切相關(guān)的Mef2c基因上一個(gè)新的致病位點(diǎn)p.L35P。在這個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生突變的小鼠產(chǎn)生了與自閉癥相似的癥狀。隨后，研究者們開(kāi)發(fā)了一款能夠直接編輯單個(gè)堿基的基因編輯器，將其嵌入病毒外殼中并給基因突變的小鼠注射，使突變的基因成功得到糾正，改善了小鼠的自閉癥行為。
圖I:L35P點(diǎn)突變顯著降低MEF2C蛋白表達(dá)水平。
圖II：L35P點(diǎn)突變通過(guò)泛素化蛋白酶體降解途徑介導(dǎo)MEF2C蛋白翻譯后快速降解。
圖III：Mef2cL35P雜合小鼠表現(xiàn)出與孤獨(dú)癥相關(guān)的異常神經(jīng)發(fā)育，突觸密度降低，抑制性中間神經(jīng)元數(shù)量下降及異常的電生理表型，且出現(xiàn)孤獨(dú)癥相關(guān)的行為學(xué)表型。
圖IV：基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的新型胞嘧啶單堿基編輯系統(tǒng)，通過(guò)體內(nèi)及體外驗(yàn)證了其在目標(biāo)靶點(diǎn)的堿基編輯效率以及脫靶事件，證明該系統(tǒng)是高效，準(zhǔn)確且安全的。
圖片來(lái)源：《自然·神經(jīng)科學(xué)》
“目前，自閉癥的治療是醫(yī)學(xué)中的難點(diǎn)之一，尚沒(méi)有特效藥能夠治療自閉癥?！睂?duì)于該研究，上?？萍即髮W(xué)的朱俊杰博士與陳佳研究員評(píng)論道，“這項(xiàng)研究證明了體內(nèi)堿基編輯在神經(jīng)發(fā)育障礙治療中的潛力，同時(shí)也為其他類(lèi)型的堿基編輯器在腦內(nèi)遞送以及編輯帶來(lái)了新的啟發(fā)。”
p.L35P基因突變或?qū)е伦蚤]癥
自閉癥譜系障礙（AutismSpectrumDisorder，簡(jiǎn)稱ASD），是一類(lèi)嚴(yán)重影響兒童身心健康的神經(jīng)發(fā)育疾病，患者表現(xiàn)出嚴(yán)重程度不同的社交障礙以及重復(fù)刻板行為。
根據(jù)美國(guó)疾控中心統(tǒng)計(jì)，自閉癥的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，2022年美國(guó)自閉癥患病率約為1/361。中國(guó)對(duì)于6-12歲自閉癥兒童患病率的統(tǒng)計(jì)顯示，男孩約為0.44%-0.95%，女孩約為0.12%-0.30%。
自閉癥與先天和環(huán)境條件密切相關(guān)，而基因被視為重要因素之一。近年來(lái)研究者們發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種自閉癥風(fēng)險(xiǎn)基因及致病基因突變，包括與神經(jīng)粘著分子、離子通道蛋白等神經(jīng)細(xì)胞中的各種蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的基因。其中，Mef2c基因已被證實(shí)是一個(gè)很重要的自閉癥風(fēng)險(xiǎn)基因，突變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育遲滯及一系列嚴(yán)重癥狀。
“有研究結(jié)果表明，Mef2c基因在成年小鼠的大腦皮質(zhì)、海馬體和杏仁核中大量表達(dá)，其能夠調(diào)節(jié)突觸可塑性和谷氨酸能突觸的數(shù)量，是ASD相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)基因之一。Mef2c的突變會(huì)導(dǎo)致兒童大腦發(fā)育缺陷，其特征為精神運(yùn)動(dòng)障礙，缺乏言語(yǔ)，異常運(yùn)動(dòng)模式等?！敝炜〗懿┦颗c陳佳研究員評(píng)論道。
一段具備特定功能的基因序列中的單個(gè)或多個(gè)堿基變化都可能對(duì)功能產(chǎn)生影響。在本研究中，仇子龍研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)全外顯子組測(cè)序技術(shù)在一例中國(guó)的自閉癥患兒的Mef2c基因上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新發(fā)點(diǎn)突變（denovomutation）,c.T104C，p.L35P。這個(gè)新發(fā)點(diǎn)突變對(duì)于Mef2c基因功能的影響未知。
為了研究該位點(diǎn)對(duì)Mef2c的影響，研究團(tuán)隊(duì)首先利用分子細(xì)胞生物學(xué)的研究方法在體外探究了L35P點(diǎn)突變對(duì)Mef2c蛋白結(jié)構(gòu)、表達(dá)以及功能上的影響及其分子機(jī)制。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)L35P突變會(huì)導(dǎo)致Mef2c蛋白質(zhì)發(fā)生依賴泛素化蛋白酶體途徑的快速降解，最終顯著降低Mef2c蛋白的表達(dá)水平。
隨后，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了Mef2cL35P點(diǎn)突變敲入小鼠模型，并通過(guò)生物化學(xué)、免疫熒光成像以及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)探究了其神經(jīng)發(fā)育及行為學(xué)表型。研究發(fā)現(xiàn)Mef2cL35P雜合突變小鼠大腦中存在自閉癥相關(guān)的神經(jīng)生理學(xué)特征以及發(fā)育異?，F(xiàn)象，并且表現(xiàn)出社交障礙以及刻板行為等自閉癥核心癥狀的行為學(xué)表型。
體內(nèi)基因治療修復(fù)小鼠變異
目前研究多集中在基因突變導(dǎo)致自閉癥的分子與環(huán)路機(jī)制上，是否可以運(yùn)用基因編輯方法對(duì)導(dǎo)致自閉癥的基因突變?cè)诖竽X內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確的修復(fù)還未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，研究者們使用首次使用基因編輯修復(fù)了自閉癥小鼠神經(jīng)元中L35P的基因突變。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過(guò)程中產(chǎn)生的適應(yīng)性的免疫防御機(jī)制，通過(guò)這一系統(tǒng)細(xì)菌能夠識(shí)別并剪切外來(lái)的噬菌體和病毒的DNA。在其基礎(chǔ)上，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出了一套基因編輯系統(tǒng)，使得精確高效的基因編輯成為可能。這項(xiàng)技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)之一在于，CRISPR/Cas9可能會(huì)與不是目標(biāo)序列的DNA產(chǎn)生錯(cuò)配，進(jìn)而導(dǎo)致非預(yù)期的基因突變，這被稱為“脫靶效應(yīng)”。
在本研究中，仇子龍和程田林團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9的新型胞嘧啶單堿基編輯系統(tǒng)（APOBEC3AembeddingCytosineBaseEditor，AeCBE，已申請(qǐng)相關(guān)發(fā)明專(zhuān)利），使其能夠?qū)⑿∈驧ef2c基因中特定位置上異常的C·G堿基對(duì)轉(zhuǎn)換成正常的T·A堿基對(duì)。
為了能夠使得新型CBE系統(tǒng)成功地跨越小鼠血腦屏障（bloodbrainbarrier，BBB），研究團(tuán)隊(duì)將AeCBE系統(tǒng)包裝進(jìn)PHP.eB血清型的腺相關(guān)病毒（Adeno-associatedvirus，AAV）中，并且利用單次小鼠尾靜脈注射AAV的遞送方式，使得AeCBE系統(tǒng)在小鼠大腦中多個(gè)腦區(qū)得以成功表達(dá)。經(jīng)AeCBE系統(tǒng)編輯后，研究團(tuán)隊(duì)在體內(nèi)檢測(cè)到較高的單堿基編輯效率以及低脫靶事件，驗(yàn)證了新開(kāi)發(fā)的AeCBE系統(tǒng)具備高效性、準(zhǔn)確性且安全性的特點(diǎn)。
最后，研究團(tuán)隊(duì)檢測(cè)了經(jīng)過(guò)AeCBE系統(tǒng)介導(dǎo)的基因治療后Mef2cL35P突變雜合小鼠大腦中的神經(jīng)生理學(xué)變化以及行為學(xué)表型。在經(jīng)過(guò)單堿基編輯技術(shù)介導(dǎo)的基因修復(fù)后，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Mef2cL35P突變雜合小鼠大腦中降低的Mef2c蛋白表達(dá)水平得到恢復(fù)，并且其社交障礙以及重復(fù)刻板性行為也得到了明顯的改善。
這項(xiàng)研究成果表明基因編輯技術(shù)有望為腦部遺傳疾病患者帶來(lái)福音。“近年來(lái)，堿基編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域，特別是基于血紅蛋白病、早衰癥、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)肌肉病、心肌病、耳聾等疾病的基因治療?！比A東師范大學(xué)李大力教授說(shuō)，“這項(xiàng)研究通過(guò)在體全腦堿基編輯首次實(shí)現(xiàn)了自閉癥小鼠的有效治療，為自閉癥治療提供了新的思路，并進(jìn)一步表明了堿基編輯技術(shù)治療遺傳性腦部疾病的巨大潛力?！?/p>
“在未來(lái)，對(duì)于腦部遺傳病的基因治療還可以有更多優(yōu)化選擇策略，比如針對(duì)需編輯的致病位點(diǎn)多樣性而使用編輯范圍更廣的工具，使用更精準(zhǔn)和親和的遞送方式等。除CBE之外，ABE編輯系統(tǒng)以及近期報(bào)道的多個(gè)基于ABE系統(tǒng)TadA脫氨酶進(jìn)化得到的新型CBE、CGBE、ACBE等編輯工具均有望在遺傳疾病的治療中得到應(yīng)用?！北本┐髮W(xué)的牛煦然博士和魏文勝教授評(píng)論道。
參考文獻(xiàn)：
https://www.nature.com/articles/s41593-023-01499-x
（原標(biāo)題：上海團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)自閉癥新基因位點(diǎn)，首次用基因編輯改善小鼠自閉行為）
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