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美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
說到肝臟，大家想到的是什么
是掛在嘴邊“肝到天明”的口頭禪
是體檢不合格項目的?？汀爸靖巍?
還是肝臟獨一無二的再生能力?
......
毫無疑問，肝臟這個詞大家都是不陌生的，但對于肝臟本身大部分人就知之甚少了。實際上，我國是一個肝病大國，平均每12個人里就有一個肝病患者，眾多肝臟疾病的發(fā)病機理和治療藥物還有待探索。今天是世界肝炎日，小編就為大家介紹幾種常見的肝臟疾病和常用的動物模型，助大家在研究中快人一步。
人的肝臟位于上腹部，上與右肺、心臟相鄰，下與胃、十二指腸相鄰，肝是人體最大的消化腺，也是體內新陳代謝的中心，據(jù)估計，在肝臟中發(fā)生的化學反應有500種以上。肝臟承擔著營養(yǎng)代謝、解毒排毒、分泌膽汁、免疫防御等多種重要的生理功能。
肝臟承擔的生理功能重要且繁多，是比較容易“積勞成疾”的器官之一，我國各類肝病的患者加起來有1億多人。常見的肝病包括：脂肪肝、肝實質細胞損傷、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化和肝癌等。動物模型對于研究肝臟異常和肝臟疾病的病理生理機制，以及確定有效的治療方法和篩選潛在的生物標志物至關重要。下面，小編為大家分別介紹肝臟研究常用的小鼠模型。
脂肪肝，大家都不陌生，誰還沒個患脂肪肝的朋友呢...
肝臟是人體的營養(yǎng)中轉站，吃下去的食物被消化吸收后會進入肝臟進行代謝。如果吸收的脂肪超過了肝臟的處理能力，它們就會沉積在肝內，形成脂肪肝，脂肪肝一般分為酒精性脂肪肝（Alcohol-related liver disease,ALD）和非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)兩大類。
2.1酒精性脂肪肝模型
酒精攝入后，少量會立即在胃中代謝，剩余的大部分酒精會被胃腸道吸收，隨后通過靜脈輸送到肝臟。肝臟是酒精代謝的主要器官，它通過幾種酶促和非酶促反應機制將90%以上酒精代謝成乙醛[1,2]。乙醛主要由乙醇脫氫酶 (ADH)、細胞色素P450 2E1 (CYP2E1) 和過氧化氫酶產(chǎn)生。乙醛隨后被醛脫氫酶 (ALDH) 轉化成乙酸，并從肝臟中釋放出來，被肌肉和心臟代謝[2]。乙醇本身和它的衍生物乙醛可使肝細胞發(fā)生脂肪變性、壞死，攝入的酒精超過肝臟的分解能力會對肝臟造成損傷。ALD模型的構建基本都是通過小鼠長期過量攝入酒精來造模的。
ALD的主要病理變化
建模小鼠選擇：
品系：C57BL/6最佳，BALB/c 及DBA老鼠在造模過程中體重會降低，死亡率較高，不太適用。C57BL/6中，6N又要比6J更易感（6J的乙醛脫氫酶水平較高，酒精代謝較6N好）。
性別：雌鼠更適合用于酒精性脂肪肝的造模，因為雌鼠胃乙醇脫氫酶水平低，同時雌激素讓肝Kuffer細胞更容易受到 LPS 和促炎癥因子的影響。
周齡：8-11周齡的老鼠（成年鼠）比較適合用于造模，老年肝細胞內乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶和CYP2E1活性均降低，更易成模。
建模方法：
直接在飲用水中加酒精造模：飲用水乙醇量通常開始從5%(v/v)開始逐步提高，小鼠可提高到25.32% (v/v) 的濃度。一般8-10周肝臟出現(xiàn)脂肪變性，長期（數(shù)月）酒精喂養(yǎng)可誘發(fā)氧化應激、脂肪變性、輕微的纖維化、炎癥細胞浸潤、肝損傷等。
Lieber-DeCarli液體酒精鼠糧造模：市面上有各種品牌的特制鼠糧可用于ALD造模。一般來講，喂食4周小鼠肝臟出現(xiàn)輕度脂肪變性，轉氨酶輕微升高，少量炎癥。喂食8-12周出現(xiàn)明顯的脂肪肝，伴有輕度炎癥和肝臟損傷，但是一般沒有纖維化[6]。
胃內插管造模：上述造模方法只能得到早期ALD模型，為了模擬晚期ALD，1984 年 Tsuka moto和同事嘗試了一種新方法，直接通過手術將插管植入小鼠胃內，研究者借此可以完全控制小鼠乙醇攝入量。通過長期將小鼠血液中的酒精維持在250–500 mg/dl 的水平，可以在小鼠上模擬人類 ALD 的病理變化，包括微泡和大泡脂肪，巨線粒體、細胞凋亡、中央壞死和混合炎性浸潤，中央小葉和細胞周圍纖維化，門靜脈纖維化，橋接纖維化等[7]。
水/酒自由選擇造模：同時給小鼠提供正常飲用水和含酒精應用水（或不同酒精濃度的飲用水）。因為嚙齒動物不會被迫喝酒精來緩解饑餓或口渴，這種方法可以篩選（培養(yǎng)）出小鼠中的“酒鬼”，與人類嗜酒行為更相似。這種模型可以模擬酒精成癮，用于研究分子和神經(jīng)化學途徑導致酒精濫用的行為和成癮機制[3]。
2.2非酒精性脂肪肝模型
伴隨肥胖人群的激增，非酒精性肝?。∟AFLD）的發(fā)病率在過去20年發(fā)生了一波爆發(fā)式的增長。NAFLD 如果不能得到有效治療，會逐漸進展到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纖維化（Fibrosis）。此時通過積極干預，肝臟仍可能恢復正常，一旦進展到肝硬化（Cirrhosis），將會有約 1~4% 的患者最終進展為肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。目前的假說認為NASH是多種因素共同作用的后果，包括遺傳、肥胖、代謝綜合癥（比如高血壓、高血糖）、心血管疾病、糖尿病等。
NAFLD/NASH發(fā)病特征
食源性肥胖和胰島素抵抗是最常見的人類代謝疾病的誘因，各類特制飼料常用在NAFLD/NASH造模中。
MCD(Methionine- and choline-deficient diet)造模：MCD飲食中缺乏蛋氨酸和膽堿，蛋氨酸是合成半胱氨酸的關鍵化合物，膽堿是乙酰膽堿的前體，它們是肝臟和成磷脂酰膽堿的必要原料，缺乏磷脂酰膽堿會導致極低密度脂蛋白VLDL無法正常組裝，甘油三酯 (TG)無法轉運，在肝臟大量積聚。小鼠MCD飲食3周后通常會出現(xiàn)明顯的脂肪性肝炎，5-8 周后出現(xiàn)明顯的纖維化，10 周后肝臟出現(xiàn)大量壞死性炎癥灶，但MCD模型不會出現(xiàn)NAFLD相關的代謝綜合征；此外，小鼠喂食 MCD會出現(xiàn)嚴重的體重下降，8周的喂養(yǎng)會失去約40%的體重，很可能是因為代謝亢進[8]。
CDAA(Choline-deficient L-amino-defined diet)造模：與MCD飲食相似，CDAA也缺乏膽堿，但是CDAA配方含有少量蛋氨酸，因此CDAA誘導花費的時間比MCD飲食長，約在12周后小鼠會出現(xiàn)NASH并伴有纖維化，21周纖維化可以進展到中期，經(jīng)常以 CDAA 為食的嚙齒動物表現(xiàn)出與纖維化相關的肝腫瘤。相較于MCD造模，CDAA造模進展溫和，可用于研究從 NAFLD 到 NASH 再到 HCC 的進展。值得注意的是，這些病變很少出現(xiàn)在雌性小鼠上[9]。
HFD(High-fat diet)造模：高脂飲食沒有人為的減少必要營養(yǎng)成分，只是提高了飼料中的脂肪含量，這可以更好的模擬人類肥胖和NAFLD的發(fā)病過程。HFD造模的效果與品系和性別均有關，通常雄性比雌性更容易肥胖；品系上，C57BL/6 比BALB/c更容易成模。事實上，C57BL/6 小鼠自身具有肥胖、高胰島素血癥和葡萄糖耐受不良的遺傳背景。
HFD衍生造模：在HFD的基礎上增減飼料成分，以期達到更好的造模效果。例如，去除HFD飼料中的膽堿choline，或在HFD飼料中添加果糖、膽固醇或反式脂肪酸、化合物CCL4等[3]。
ALD和 NAFLD/NASH 常用模型的主要特征
除飲食誘導外，我們還可以通過基因修飾的方法，敲除Adh, Ldlr等關鍵基因，阻斷脂肪代謝來構建脂肪肝模型，相關的基因修飾模型詳見文末表格。
需要注意的是，理想的NAFLD/NASH小鼠模型應該能模擬人類NAFLD/NASH的發(fā)病過程，實際上，現(xiàn)有的很多模型僅在組織病理上的變化與臨床 NASH 很相似，但是肝臟的代謝、疾病的成因并不相同。例如，MCD和CDAA誘導雖然可以形成與 NASH 相似的病理組織如肥胖、炎癥、纖維化，然而，臨床 NASH 患者并不會出現(xiàn)膽堿缺乏。此外，MCD小鼠模型會出現(xiàn)體重下降而不是升高的特點，這一點在病理生理學與臨床NASH癥狀相反。
肝損傷/肝纖維化/肝硬化模型
肝損傷主要指肝實質細胞的功能損傷或壞死。臨床肝損傷主要由飲酒、食物中毒、藥物毒性、病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化及膽汁淤積癥等引起。嚴重的急性肝損傷可發(fā)展為肝衰竭，危及生命；慢性肝損傷則可能向肝纖維化、肝硬化、肝癌的終末期發(fā)展。肝纖維化幾乎伴隨著所有的慢性肝疾病。
慢性肝病的主要病理變化
肝損傷造模一般通過腹腔注射或小鼠尾靜脈注射特定化合物（如：CCl4、APAP、ConA、LPS&D-GalN等）即可，造模周期短。通常肝損傷模型構建數(shù)小時后，小鼠即出現(xiàn)急劇的肝細胞死亡、肝衰竭乃及死亡；而低劑量重復注射化合物則可以緩慢積累肝損傷，導致肝纖維化、肝硬化的產(chǎn)生。
CCl4誘導：不同劑量的四氯化碳（CCl4）可分別造成小鼠急性或慢性肝損傷發(fā)生。高劑量CCl4在肝細胞內經(jīng)過細胞色素p-450依賴性途徑產(chǎn)生有肝臟毒性的自由基代謝產(chǎn)物，從而導致肝損傷；低劑量、多次數(shù)的CCl4注射能夠導致肝細胞變性、壞死以、肝臟纖維化及肝硬化發(fā)生。
APAP誘導：由于臨床上對乙酰氨基酚（APAP）的過量使用是導致病人肝毒性的重要因素，因此，小鼠口服高劑量的APAP也是常用的誘導肝損傷的模型。
LPS與D-GalN誘導：該模型主要用于研究巨噬細胞作用機制。D-GalN（D-galactosamine，半乳糖苷）作為一種特異性的肝臟致敏劑，能夠參與肝細胞代謝并特異地消耗尿嘧啶，從而抑制細胞的轉錄活性，導致NF-κB下游靶基因不能正常表達發(fā)揮抗凋亡作用。腹腔聯(lián)合注射LPS和D-GalN常作為研究巨噬細胞分泌的TNFα誘導急性肝損傷的經(jīng)典模型。
ConA誘導：ConA（刀豆蛋白）作為一種T細胞絲裂原，能夠激活NK細胞釋放IFN-γ，促進T細胞活化，從而導致急性肝損傷發(fā)生。目前被廣泛應用于研究 NKT 細胞在肝臟損傷中作用機制。
ConA作用機制
Fah敲除模型：化學物質誘導肝損傷通常是劇烈且不可逆的，不能模擬臨床非化學肝毒性因素的肝損傷的病理狀態(tài)和機制，也無法觀察從肝損傷到肝硬化這一漸變過程。通過敲除關鍵基因構建慢性肝損傷模型可以克服這個問題，并可獲得大量特性均一的動物模型，如Fah-KO小鼠（NM-KO-191202），它敲除了延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoacetatehydrolase，F(xiàn)ah)。正常情況下，酪氨酸最終代謝為延胡索酰和乙酰乙酸。Fah基因敲除后，產(chǎn)生有毒的延胡索酰乙酰乙酸鹽和馬來酰乙酰乙酸，并產(chǎn)生其次級代謝產(chǎn)物丙酮，對肝、腎造成損傷，引起肝臟損傷和肝硬化[4]。
病毒性肝炎模型
病毒性肝炎（viral hepatitis)是由多種不同肝炎病毒引起的一組以肝臟損害為主的傳染病，可分為甲、乙、丙、丁、戊、庚六種類型。其中，乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎，多經(jīng)輸血或血制品以及密切接觸傳播，易遷延發(fā)展成慢性甚至肝硬化，已證實乙型（HBV）和丙型（HCV）肝炎病毒感染與肝癌有一定關系。在此主要介紹HBV和HCV小鼠模型。
病毒性肝炎分類
4.1 HBV小鼠模型
常見HBV小鼠模型造模方法如下：
lHBV病毒注射：將 HBV 質粒 DNA 直接注射到小鼠體內，這種造模方法可以制作不同毒株的模型，缺點是穩(wěn)定期短。
AAV轉染：腺病毒包裝HBV基因組，再進行注射，這種方法能形成與臨床相似的免疫耐受，但是小鼠無法重復感染。
人乙肝組織移植：目前最完備的HBV感染模型，可在小鼠上模擬人HBV感染，缺點是手術復雜，重復性差。
轉基因小鼠：通過基因工程技術，將HBV基因組敲入小鼠基因組，小鼠模型可終生表達HBV，這種模型的優(yōu)點是穩(wěn)定性高重復性好，缺點是無法模擬臨床感染過程，無法根除HBV。
南模生物將c1型HBV病毒1.0拷貝全長DNA轉入小鼠，構建了攜帶HBV病毒的轉基因小鼠HBV-Tg（貨號：NM-TG-00003）。該轉基因小鼠血清中HBsAg呈陽性，但無HBeAg、anti-HBs、anti-HBe或antiHBc表達，無HBV DNA復制。在該轉基因小鼠模型的血清、肝臟和腎臟中可以檢測到穩(wěn)定表達的人乙肝病毒表面抗原，該小鼠模型為研究人類“乙型肝炎”的發(fā)病機制、治療方法與藥物篩選，提供了理想的動物模型和新型研究手段，具有重要的醫(yī)藥應用價值。
免疫組化檢測HBsAg在肝臟(A)和腎臟(B)中的表達
4.2 HCV小鼠模型
HCV只能感染靈長類，長期以來都沒有可用的小動物模型。將 HCV 在人肝細胞膜表面表達的受體基因轉入小鼠，可使小鼠感染 HCV，例如人源化小鼠的CD81和OCLN基因(南模貨號：NM-HU-2000107)，可使HCV病毒正常感染小鼠肝臟[10]。還有研究發(fā)現(xiàn)，應用人源化肝臟小鼠也可以建立HCV感染小鼠模型[5]。
鑒于靈長類和嚙齒類在病毒易感性和感染機制上的差異，病毒模型更多的采用食蟹猴作為模式動物。但在前期的研究中，綜合考慮成本等方面的因素，也可以選擇免疫缺陷小鼠注射相應病毒來造模。
肝癌模型
肝癌的發(fā)生是一個多階段逐漸演變惡化的過程，從最初的肝炎到肝硬化，再到最后的肝癌，是一個多步驟的發(fā)展過程。肝癌模型的構建方法較多，可以用化學致癌劑誘導，可以移植肝癌細胞或組織建模，還可以通過修飾關鍵抑癌基因或原癌基因造模。
肝臟病變進展
5.1誘發(fā)性肝癌模型
許多化學致癌劑達到足夠的劑量及時間可誘發(fā)動物形成腫瘤。常用的肝癌誘導劑包括：二乙基亞硝胺（DEN）、黃曲霉素B1(AFB1)、四氯化碳（CCl4）等。
誘發(fā)性肝癌模型優(yōu)點：可以模擬腫瘤發(fā)生的3個過程，即損傷，硬化和腫瘤。
誘發(fā)性肝癌模型缺點：誘導周期長，致死率高，個體間肝癌發(fā)生的時間、部位及病灶數(shù)等不均一。
5.2 移植性肝癌模型
移植性肝癌小鼠模型是指將小鼠或人的肝癌組織、細胞株或其他惡性腫瘤（如乳腺癌）移植到小鼠體內形成的動物模型。是肝癌研究常用的模型之一，適用于抗癌藥物臨床前的藥效評價。
PDX模型
目前，常見的移植性肝癌模型主要分為兩種，一種是將人源的肝癌細胞系（HepG2, Hep3B, SMMC-7721, HuH7等）接種到免疫缺陷小鼠體內，稱為CDX模型（cell-line-derived xenograft），另一種是將來源于患者的肝癌組織塊接種到免疫缺陷小鼠體內，稱為PDX模型（patient-derived xenograft），南模生物已累計構建了近百種肝癌PDX模型。
5.3 基因修飾肝癌模型
利用基因工程手段構建的肝癌小鼠不僅能從動物整體的組織器官水平上進行研究，而且還可以深入到細胞和分子水平，為肝癌的發(fā)病機制、藥物篩選和臨床醫(yī)學研究提供理想的實驗動物模型，南模生物自主構建了多種敲除，條件性敲除的肝癌小鼠模型，模型信息詳見文末表格。
南模生物深耕基因編輯領域，提供全方位模式生物服務，包括基因修飾成品模型供應、個性化模型定制、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥效評價等，滿足不同實驗室需求。
參考文獻:
1.Ramchandani, V.A.; Bosron, W.F.; Li, T.K. Research advances in ethanol metabolism. Pathol. Biol. (Paris) 2001, 49, 676–682.
2.Crabb, D.W.; Matsumoto, M.; Chang, D.; You, M. Overview of the role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase and their variants in the genesis of alcohol-related pathology. Proc. Nutr. Soc. 2004, 63, 49–63.
3.Nevzorova YA, Boyer-Diaz Z, Cubero FJ, Gracia-Sancho J: Animal Models for Liver Disease - A Practical Approach for Translational Research. J Hepatol 2020.
4.R. Berger, G. P. Smit, S. A. Stoker-de Vries, M. Duran, D. Ketting, and S. K. Wadman, 'Deficiency of Fumarylacetoacetase in a Patient with Hereditary Tyrosinemia', Clin Chim Acta, 114 (1981), 37-44.
5.Humanized Mouse Models for the Study of Hepatitis C and Host Interactions.Cells. 2019 Jun; 8(6): 604, Pages 1-27.
6.Lamas-Paz A, Hao F, Nelson LJ, Vazquez MT, Canals S, Gomez Del Moral M, et al. Alcoholic liver disease: utility of animal models. World J Gastroenterol 2018;24:5063–5075.
7.Tsukamoto H, Reidelberger RD, French SW, Largman C. Long-term cannulation model for blood sampling and intragastric infusion in the rat.Am J Physiol 1984;247:R595–R599.
8.Corbin KD, Zeisel SH. Choline metabolism provides novel insights into nonalcoholic fatty liver disease and its progression. Curr Opin Gastroenterol 2012;28:159–165.
9.Farrell G, Schattenberg JM, Leclercq I, Yeh MM, Goldin R, Teoh N, et al.
Mouse models of nonalcoholic steatohepatitis: toward optimization of their relevance to human nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2019;69:2241–2257.
10.J Virol . 2017 Jan 31;91(4):e01799-16. doi: 10.1128/JVI.01799-16. Print 2017 Feb 15. Mice Expressing Minimally Humanized CD81 and Occludin Genes Support Hepatitis C Virus Uptake In Vivo Qiang Ding, Markus von Schaewen, Gabriela Hrebikova, Brigitte Heller, Lisa Sandmann, Mario Plaas, Alexander Ploss.
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