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生殖顆粒是特異性存在于動物生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的無膜細(xì)胞器（MLOs），參與多種RNA相關(guān)的代謝過程，包括小RNA加工、mRNA儲存、mRNA翻譯和降解等。在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞中存在著一類位于線粒體簇之間的生殖顆粒，被稱為intermitochondrial cement（IMC）。piRNA是一種在生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)的小非編碼RNA，與 PIWI蛋白結(jié)合形成復(fù)合物通過抑制轉(zhuǎn)座子、調(diào)節(jié)基因表達(dá)等機(jī)制促進(jìn)精子發(fā)生的正常進(jìn)行。IMC的組分中包含大量與piRNA生成有關(guān)的蛋白，因此IMC被認(rèn)為是piRNA加工的主要場所。哺乳動物生殖細(xì)胞中IMC的形成對于piRNA生成以及精子發(fā)生至關(guān)重要，然而目前對于IMC的形成機(jī)制一直未知。研究表明，相分離（phase separation）通過生物大分子（包括蛋白質(zhì)、RNA、DNA等）之間的多價相互作用形成大分子凝聚物，在細(xì)胞中促進(jìn)多種無膜細(xì)胞器的形成。在果蠅、線蟲以及斑馬魚的生殖細(xì)胞中，相分離參與多種生殖顆粒的組裝。但是，相分離是否參與哺乳動物生殖顆粒的組裝還不清楚。

2024年7月18日，同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院丁德強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)在Developmental Cell上在線發(fā)表題為TDRD1 phase separation drives intermitochondrial cement assembly to promote piRNA biogenesis and fertility的文章。該研究揭示了TDRD1蛋白通過相分離活性驅(qū)動IMC組裝的分子機(jī)制，并證明相分離驅(qū)動的IMC組裝對于piRNA的生成、轉(zhuǎn)座子沉默以及雄性生殖細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。

已知TDRD1蛋白定位于雄性生殖細(xì)胞的IMC中，TDRD1缺失導(dǎo)致piRNA生成缺陷以及精子發(fā)生停滯【5】。為了研究TDRD1蛋白的分子功能，研究人員首先借助熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)融合與分離實(shí)驗(yàn)以及體外純化蛋白的相分離實(shí)驗(yàn)證明TDRD1蛋白在細(xì)胞內(nèi)和體外具有相分離活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TDRD1通過位于C端的coiled-coil超螺旋結(jié)構(gòu)域自我相互作用，并自組裝成四聚體來驅(qū)動相分離活性。

通過一系列突變質(zhì)粒的篩選，研究人員鑒定出coiled-coil結(jié)構(gòu)域中的疏水氨基酸基序（1149ILLFLL1154）對于TDRD1的自我相互作用以及相分離活性至關(guān)重要。將疏水氨基酸基序突變后，TDRD1無法自我相互作用，從而失去相分離活性。除此之外，TDDR1蛋白包含4個串聯(lián)的Tudor結(jié)構(gòu)域。研究人員發(fā)現(xiàn)Tudor結(jié)構(gòu)域通過識別對稱精氨酸二甲基化修飾（sDMA）的蛋白，來促進(jìn)TDRD1發(fā)生相分離。因此，TDRD1通過coiled-coil結(jié)構(gòu)域的自組裝以及Tudor-sDMA相互作用來獲得多價相互作用，協(xié)同促進(jìn)TDRD1相分離活性。

為了研究TDRD1相分離活性在生殖細(xì)胞中的生理功能，研究人員制作了TDRD1相分離活性缺失突變小鼠。研究人員將TDRD1蛋白C端coil-coil結(jié)構(gòu)域中的疏水氨基酸基序ILLFLL突變成GSGSGS，使得TDRD1蛋白在生殖細(xì)胞中失去相分離活性。TDRD1相分離活性缺失突變小鼠雄性不育，其精子發(fā)生停滯在減數(shù)分離前期，無法產(chǎn)生成熟精子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TDRD1相分離活性缺失導(dǎo)致IMC無法組裝，piRNA生成量顯著下降，轉(zhuǎn)座子異常激活。這些結(jié)果證明了TDRD1相分離對于雄性生殖細(xì)胞中IMC的組裝以及功能發(fā)揮至關(guān)重要。

最后，研究人員發(fā)現(xiàn)TDRD1的相分離活性在脊椎動物中具有很強(qiáng)的保守性，而在非脊椎動物中并不保守。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)非脊椎動物的TDRD1同源蛋白缺少C端coiled-coil結(jié)構(gòu)域，因此無法發(fā)揮相分離的活性。研究人員的這一發(fā)現(xiàn)解釋了為什么IMC在脊椎動物生殖細(xì)胞中普遍存在，而在非脊椎動物生殖細(xì)胞中卻并不顯著。 

綜上所述，該研究揭示了TDRD1相分離活性的分子機(jī)制以及TDRD1相分離活性在生殖細(xì)胞中的IMC組裝、piRNA生成和轉(zhuǎn)座子沉默中的生理作用。該研究將相分離與哺乳動物生殖顆粒的組裝聯(lián)系起來，為研究生殖細(xì)胞中無膜細(xì)胞器的形成以及功能發(fā)揮提供了新的思路，對于進(jìn)一步理解哺乳動物精子發(fā)生的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。