如今，RNA干擾技術(shù)被越來越多地用于調(diào)控人類基因的表達。動植物存在一類長度約為22 nt的非編碼單鏈RNA分子microRNA（miRNA），能夠通過RNAi參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達調(diào)控?？蒲腥藛T在線蟲系統(tǒng)性RNAi的研究中發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白SID-1（systemic RNA interference defective protein 1）在介導(dǎo)外源雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）的吸收方面具有重要作用，是重要的核酸轉(zhuǎn)運通道。在哺乳動物細胞中，存在與SID-1有相似核酸轉(zhuǎn)運功能的兩個同源跨膜蛋白——SIDT1和SIDT2（SID1 transmembrane family member 1/2）。SIDT2參與細胞內(nèi)DNA/RNA自噬過程，并將溶酶體內(nèi)化的核酸轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，引發(fā)先天免疫反應(yīng)；SIDT1更是直接介導(dǎo)食物性來源miRNA的吸收。研究發(fā)現(xiàn)，胃部是吸收食物小RNA的主要部位，在哺乳動物的胃粘膜頂細胞（pit cell）上表達的SIDT1是吸收外源小RNA的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。這一過程在極低pH的胃酸環(huán)境下得到顯著促進，且酸刺激極大程度地促進了miRNA的吸收。這一發(fā)現(xiàn)為小RNA的“跨界調(diào)控”提供了進一步的證據(jù)，為基于小RNA的治療提供了新策略，并為基于RNA的藥物開發(fā)提供了潛在方向。雖然越來越多的相關(guān)研究均支持哺乳動物SID-1跨膜家族蛋白SIDT1和SIDT2介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)運，但是SID-1跨膜家族蛋白SIDT1和SIDT2介導(dǎo)異源小RNA吸收的分子機制仍然不夠清晰，特別是關(guān)于低pH條件下促進小RNA吸收過程的機制仍然未知。
中國科學院生物物理研究所孫飛課題組聯(lián)合南京大學生命科學學院籍曉云課題組、張辰宇課題組，在《細胞研究》（Cell Research）上，在線發(fā)表了題為Cryo-EM structures of human SID-1 transmembrane family proteins and implications for their low-pH-dependent RNA transport activity的研究論文。該研究利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)，首次同時解析了人源SIDT1和SIDT2蛋白質(zhì)的同源二聚體三維結(jié)構(gòu)。本研究首次發(fā)現(xiàn)，SIDT1和SIDT2可以以pH依賴的方式結(jié)合miRNA，并誘發(fā)SIDT1和SIDT2的進一步寡聚化。該成果從分子層面揭示了酸性環(huán)境促進小RNA吸收的分子機理，剖析了SIDT1和SIDT2介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)運的潛在分子機制，對探究SIDT1和SIDT2在酸性微環(huán)境中的功能調(diào)控以及RNA遞送系統(tǒng)的開發(fā)具有潛在意義。
科研團隊攻克了膜蛋白樣品表達純化的困難以及在冷凍樣品制備過程中存在的嚴重取向優(yōu)勢等難題，利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)獲得了人源SIDT1和SIDT2的三維結(jié)構(gòu)。SIDT1和SIDT2均含有一個胞外結(jié)構(gòu)域（extracellular domain，ECD）、一個由11次跨膜螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain， TMD），以及一個柔性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（intracellular domain，ICD）。研究通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)SIDT1和SIDT2的結(jié)構(gòu)高度相似，這提示它們可能具有相似的生物學功能。同時，研究還發(fā)現(xiàn)了進化保守的位點如二硫鍵和糖基化位點。它們對SIDT1和SIDT2酸性條件下的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性起著重要作用。此外，研究人員檢測了SIDT1和SIDT2在體外和活細胞中的聚合狀態(tài)。結(jié)果表明，這兩種蛋白質(zhì)均以二聚體或寡聚體的形式存在，且TMD對于維持二聚體至關(guān)重要。上述成果為闡釋SIDT1和SIDT2在體內(nèi)的功能提供了重要信息。
為了揭示SIDT1和SIDT2介導(dǎo)小RNA轉(zhuǎn)運的分子機制，研究進一步探討了它們的ECD與小RNA的結(jié)合情況。實驗結(jié)果顯示，SIDT1和SIDT2的ECD能夠以pH依賴性方式有效地與小RNA結(jié)合。在酸性條件下，ECD與小RNA的親和力增加，且這種結(jié)合進一步引發(fā)了ECD的寡聚化。這推翻了前期報道的SIDT1ECD和SIDT2ECD只能結(jié)合較長的雙鏈RNA（>100 bp）的觀點。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，ECD蛋白在酸性條件下與核酸的結(jié)合，不受核酸種類、單雙鏈的特異性影響，且這種結(jié)合存在pH依賴性。通過分析型超速離心和凝膠過濾層析分析，研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，SIDT1和SIDT2與核酸結(jié)合能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的寡聚化，這表明它們具有形成核酸孔道的潛力。該研究揭示了低pH環(huán)境在促進SIDT1和SIDT2吸收外源小RNA的關(guān)鍵作用，深化了在低pH條件下促進小RNA的跨膜吸收的分子機制理論基礎(chǔ)。
綜上，該研究解析了哺乳動物細胞跨膜家族蛋白SIDT1和SIDT2的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并首次提出了SIDT1和SIDT2與RNA的pH依賴性結(jié)合和寡聚化的分子特征。因此，該成果為SID-1跨膜家族蛋白在核酸轉(zhuǎn)運方面奠定了分子基礎(chǔ)，并為“基因跨界調(diào)控”現(xiàn)象提供了直接的理論分子依據(jù)。
研究工作獲得國家重點研發(fā)計劃和國家自然科學基金等的支持。部分樣品制備、數(shù)據(jù)收集和分析等工作得到生物物理所蛋白質(zhì)科學研究平臺生物成像中心的協(xié)助。上?？萍即髮W的科研人員參與研究。
SIDT1和SIDT2同源二聚體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
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